单细胞转录组分析揭示脑内皮细胞的年龄相关重塑

《Aging Brain》：Single-cell transcriptomic analysis reveals age-related remodeling of brain endothelial cells

　　

血脑屏障（BBB）完整性随年龄自然下降。脑内皮细胞（ECs）和周细胞（PCs）形成BBB，衰老会损害紧密连接，可能通过改变PC-to-EC信号传导。然而，这种损害的分子机制仍不清楚。使用单细胞RNA测序，研究人员分析了来自年轻和年老小鼠的68,316个脑ECs，表达15,564个基因。无监督聚类和注释揭示了五种不同的EC亚型——毛细血管EC1、毛细血管EC2、动脉EC、静脉EC1和静脉EC2——分别由标记基因Mfsd2a、Plvap、Bmx、Nr2f2和Vcam1定义。衰老改变了EC亚型分布，与年轻小鼠相比，毛细血管EC1减少（45% vs. 57%），动脉EC增加（33% vs. 16%），静脉EC增加（12% vs. 2%）。Milo分析进一步显示，老化脑中毛细血管EC1和静脉EC2邻域丰度降低。与年轻小鼠相比，年老小鼠的生物素代谢降低，特别是在毛细血管EC1、毛细血管EC2和动脉EC中。尽管在EC亚群中观察到广泛的基因下调，但整体表达趋势在簇间基本一致。关键基因——Ramp2、Hbb-bs、Ly6c1、Calm1——丰度降低，而Rasgrf2在年老小鼠中独特富集。免疫组化证实了年老小鼠和人脑中LY6C和RAMP2降低，RASGRF2升高。细胞-细胞相互作用分析揭示了年龄相关的配体-受体信号重塑。富集分析涉及神经血管完整性、炎症、淀粉样蛋白处理和血管重塑途径。总之，这些发现表明衰老重新编程了EC亚型组成、基因表达和代谢，从而促进BBB破坏和神经血管功能障碍。

**论文解读：单细胞转录组分析揭示脑内皮细胞的年龄相关重塑**

**研究背景与问题**
血脑屏障（BBB，由脑内皮细胞（ECs）和周细胞（PCs）形成的选择性屏障）完整性随年龄自然下降，导致神经血管功能障碍和神经退行性疾病风险增加。衰老过程中，ECs经历紧密连接蛋白破坏、炎症信号增强和转运系统受损，但不同EC亚型（如毛细血管、动脉、静脉）的分子变化机制尚不明确。既往单细胞RNA测序（scRNA-seq，一种在单个细胞水平分析基因表达的技术）研究多聚焦于整体EC群体，未系统解析亚型组成、基因表达动态、代谢通路和细胞间通讯的年龄相关重塑。因此，研究人员开展本研究，旨在通过scRNA-seq全面揭示年轻和年老小鼠脑ECs的转录组异质性，阐明衰老如何选择性影响EC亚型功能并导致BBB破坏。

**研究结论与意义**
研究人员发现，衰老主要改变EC亚型比例（毛细血管EC1减少，动脉EC和静脉EC2增加），而非广泛重编程基因表达。关键功能基因（如Ramp2、Hbb-bs、Ly6c1、Calm1）下调，而Rasgrf2在年老小鼠中独特富集。生物素代谢在毛细血管EC中降低，细胞间通讯网络重塑，涉及神经血管完整性、炎症和淀粉样蛋白处理通路。这些发现为理解EC衰老的分子机制提供了基础资源，并识别出潜在靶点（如RAMP2、RASGRF2）以保护BBB完整性。论文发表在《Aging Brain》。

**主要关键技术方法**
研究人员使用以下关键技术：1）单细胞RNA测序（scRNA-seq）对年轻（14周龄，n=3雄性）和年老（84周龄，n=3雄性）C57BL/6J小鼠全脑样本进行转录组分析；2）PhenoGraph无监督聚类和CellTypist注释识别5种EC亚型；3）DESeq2进行伪批量差异表达分析（DEGs，差异表达基因）；4）Milo分析评估EC亚型差异丰度；5）SPECTRA因子分析定量生物素代谢通路；6）LIANA（CellPhoneDB方法）推断细胞间配体-受体相互作用；7）Palantir伪时间分析追踪基因表达趋势；8）免疫组化（IHC）在额外小鼠（4M:4F）、恒河猴（6M:6F）和人脑组织（5M:4F）中验证蛋白表达。

**研究结果**
**3.1 数据集特征**
通过scRNA-seq获得68,316个细胞（15,564个基因），经质量控制和细胞周期分析后，确认ECs亚群（30,462个细胞，17,724个基因）。基于标记基因（如Mfsd2a、Plvap、Bmx、Nr2f2、Vcam1）定义5种EC亚型：毛细血管EC1（Cap EC1）、毛细血管EC2（Cap EC2）、动脉EC（Art EC）、静脉EC1（Ven EC1）、静脉EC2（Ven EC2）。SEACells元细胞分析证实超过95%的元细胞映射到EC群体，验证了注释的稳健性。

**3.2 衰老改变脑内皮细胞的基因表达**
差异表达分析显示，大多数DEGs（如Nfkbia、Hsp90ab1、Calm1、Ramp2、Ly6c1、Hbb-bs）在年轻小鼠中富集，仅Rasgrf2在年老小鼠中上调。维恩图识别出四个关键基因（Ramp2、Hbb-bs、Ly6c1、Calm1）在多个EC亚型中一致下调。富集分析表明，这些基因涉及SRP依赖性共翻译蛋白靶向膜、NF-κB信号转导、TNF信号、死亡受体信号、神经退行性疾病过程等通路。基因-基因相互作用网络显示66%的基因共表达。跨数据集比较（GSE147693）发现312个共享标记，其中57个变化方向一致（8个上调，49个下调），功能涉及血管生成、内皮功能、炎症、BBB功能等。免疫组化验证了小鼠、恒河猴和人脑中LY6C和RAMP2蛋白表达降低，RASGRF2在人脑中升高，且RASGRF2富集于Ras/MAPK和EGFR通路，RAMP2富集于肾上腺髓质素受体信号和腺苷酸环化酶激活GPCR通路。

**3.3 年龄相关内皮亚型重塑伴随亚型身份保持**
亚型比例分析显示，与年轻小鼠相比，年老小鼠中Cap EC1减少（45% vs. 57%），Ven EC2增加（12% vs. 2%），Art EC增加（33% vs. 16%），Ven EC1轻微变化（17% vs. 14%），Cap EC2稳定（~2%）。核心基因（如Csf1、Apoe、Ramp2、Hbb-bs、Rasgrf2、Calm1）在收缩和扩张亚型中的表达趋势相似。Palantir伪时间分析进一步表明，衰老主要改变EC亚型比例而非核心转录程序，仅少数基因（如Slc6a6、Rasgrf2）表现出显著变化。Milo差异丰度分析显示，Cap EC1和Ven EC2邻域在年老小鼠中丰度降低，而Art EC和Ven EC1邻域富集，表明血管衰老伴随选择性EC亚型重塑。

**3.4 年龄相关的生物素代谢变化**
SPECTRA因子分析发现，生物素代谢通路在年老小鼠中整体富集程度降低，尤其表现在Cap EC1和Cap EC2亚型中，而Art EC、Ven EC1和Ven EC2中相对升高。这种变化在单细胞水平上独立于亚型比例变化，提示衰老诱导了EC亚型特异性的代谢重塑，可能影响BBB维持。

**3.5 衰老相关内皮细胞通讯网络重塑**
细胞间通讯分析（LIANA）显示，在标准化EC数量后，年老小鼠中EC-EC和EC-非EC（如周细胞、平滑肌细胞、星形胶质细胞、血管软脑膜细胞）的配体-受体相互作用密度增加，且分布更广泛。富集分析揭示，这些相互作用涉及细胞粘附、迁移、细胞表面信号以及神经血管疾病（如脑缺血、脑出血、阿尔茨海默病）通路。共享配体/受体（如ApoE、APP、PSEN1、Notch2/3、Itgb1/5）参与淀粉样蛋白处理、神经炎症和BBB完整性，表明衰老增强了EC通讯网络中的阿尔茨海默病相关信号。

**讨论与结论**
讨论部分总结：衰老主要改变EC亚型比例（Cap EC1减少，Art EC和Ven EC2增加）而非全局基因表达重编程。关键基因（Ramp2、Hbb-bs、Ly6c1、Calm1）下调导致血管完整性受损，Rasgrf2上调可能为应激反应。生物素代谢降低和通讯网络重塑进一步加剧BBB功能障碍。结论部分翻译：本研究提供了年轻和年老小鼠脑ECs的全面单细胞转录组特征，揭示了衰老如何重塑EC亚型组成、转录程序、胞内丰度和细胞间相互作用。衰老导致Cap EC1显著减少，Art EC和Ven EC扩张，表明向潜在功能障碍或炎症状态的转变。尽管表达趋势在簇间基本一致，但关键功能基因（如Ramp2、Hbb-bs、Calm1）随年龄下降，而Rasgrf2选择性富集，提示亚型特异性转录重塑。衰老还破坏胞内丰度，改变生物素代谢，并重塑配体-受体信号，涉及神经血管衰退、炎症和神经变性通路。这些发现表明，年龄相关内皮功能障碍更多由亚型丰度和邻域相互作用的变化驱动，而非细胞状态重编程，为理解EC衰老提供了基础资源，并识别出保护BBB完整性的潜在靶点。