《Brain, Behavior, & Immunity - Health》：Peripheral Blood Mononuclear Cell Proteomic Profiling Reveals Cytoskeletal- and Chromatin-Associated Protein Signatures in Autism Spectrum Disorder
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目的：研究人员旨在识别与孤独症谱系障碍（autism spectrum disorder，ASD）诊断及临床异质性相关的外周血单核细胞（peripheral blood mononuclear cell，PBMC）蛋白模式，并探索其与ASD涉及生物学过程的相关
目的：研究人员旨在识别与孤独症谱系障碍（autism spectrum disorder，ASD）诊断及临床异质性相关的外周血单核细胞（peripheral blood mononuclear cell，PBMC）蛋白模式，并探索其与ASD涉及生物学过程的相关性。方法：在一项泰国横断面队列中对191名ASD儿童与106名典型发育（typically developing，TD）对照进行PBMC蛋白质组学分析。采用质谱（liquid chromatography-tandem mass spectrometry，LC-MS/MS）鉴定差异表达蛋白（differentially expressed protein，DEP）。通过ROC分析评估临床亚组间的探索性分类性能。使用mixOmics多元整合分析评价DEP与行为及认知症状的关联。进一步将DEP与ASD相关基因及既往报道的ASD血液和脑蛋白质组数据集重叠，并借助蛋白-蛋白互作（protein-protein interaction，PPI）与富集分析进行功能注释。结果：ASD与TD对照间有39个蛋白差异表达，其中子集与ASD内部异质性相关。若干DEP由已知ASD相关基因编码，并与既往血液及脑研究中报道的蛋白重叠。功能分析富集出细胞骨架与染色质相关通路，包括以肌动蛋白为中心的互作网络。多元整合分析揭示这些蛋白与行为、社交、情绪、感觉及认知表型相关，亚组分析提示ASD内存在细微分子异质性。结论：PBMC蛋白质组学特征在该发现队列中识别出与ASD诊断及临床异质性相关的分子特征。探索性网络分析突出细胞骨架与染色质相关蛋白，支持进一步评估外周蛋白质组学作为探究ASD生物学及生物学知情分层的工具。
研究背景与立项依据
孤独症谱系障碍（autism spectrum disorder，ASD）是一组早发神经发育障碍，以社交沟通缺陷及受限重复行为为核心特征，表型高度可变且常共病注意缺陷多动障碍（attention-deficit/hyperactivity disorder，ADHD）、焦虑、智力障碍与免疫失调等。全球患病率约0.6%–1%，美国高达1/36儿童，社会经济负担重，但诊断仍依赖DSM-5与ADOS-2等行为量表，缺乏早期客观生物标志物。遗传度40%–80%，但表型异质性导致效应量小、标志物不一致，至多85%病例为特发性。蛋白直接反映活跃生物学过程，外周血单核细胞（peripheral blood mononuclear cell，PBMC）微创易得，且亚群中免疫异常与突触可塑性存在机制交集，因此研究人员假设PBMC蛋白水平可捕捉ASD行为认知变异的免疫相关信号，开展本研究以识别诊断与异质性相关的分子签名，论文发表于《Brain, Behavior, & Immunity - Health》。
主要关键技术方法
研究人员依托泰国2–18岁儿童横断面队列（191 ASD、106 TD），由发育行为儿科医师与心理师依DSM-5和CARS-2确诊与排除，ASD内部经k-means/k-medoids无监督聚类为sub1（重社交认知多动）、sub2（轻症）、sub3（中症伴重焦虑多动）三亚组；PBMC经密度梯度分离后行label-free纳米LC-MS/MS（ZenoTOF 7600），MaxQuant定量、Perseus与MetaboAnalyst处理，缺失值用QRILC填补；差异分析用BH校正t检验，分类用ROC/AUC，多组学整合用mixOmics DIABLO（sPLS-DA），互作与通路用STRING，细胞比例用CIBERSORTx对同名队列RNA-seq反卷积，并与SFARI基因、既往血清/血浆/干血斑/尸脑蛋白质组交叉比对。
研究结果
Proteomic profiling of ASD versus TD: DEPs and subgroup differences
全蛋白检出2548个，53个入筛，剔除TrEMBL未注释后剩39个DEP（37上调、2下调SLC10A3/ATXN2）。PCA显示ASD与TD分离，不受性别年龄IQ干扰，年龄性别匹配敏感性分析方向一致。亚组内Tcr-alpha在sub2升高，YDJC、AHDC1、DPYSL5呈亚组梯度差异，提示细微生物学异质性。
Proteins distinguish ASD from TD but not between clinical subtypes
ROC显示21个蛋白在某一ASD亚组vs TD的AUC>0.8（如KRT1、PCK2、ACTA2、DPYSL5、H1-2、POTEF、SLAMF9），但亚组间AUC仅0.5–0.6，个体蛋白可区分ASD/TD而难分临床亚型。
Protein signatures associated with autism heterogeneity differ from those associated with diagnosis
DIABLO模型ASD-vs-TD内部误分率1.4%，驱动蛋白为ACTBL2、ACTB、TMEM179、UIMC1；ASD-only模型误分率22.9%，sub1识别率95.5%，sub2/sub3互混，载荷最高为Tcr-alpha、YDJC、RCOR1，且RCOR1/Tcr-alpha/YDJC与CARS视觉/情绪/模仿分项强负关，Tcr-alpha与SDQ亲社会项正相关，证明诊断签名与异质性签名部分重叠但不同。
Peripheral protein networks in autism implicate cytoskeletal and chromatin remodeling functions
STRING中38个DEP构成显著互作网（p=0.000616），富集“细胞骨架结构成分”（GO:0005200）、“结构分子活性”（GO:0005198）、中间丝/细胞骨架组织（GO:0007010/0045104/0045109）及“染色质重塑”（GO:0006338），肌动蛋白中心含ACTB、ACTBL2、KRT9/14、ARPC2、MACF1；并标注突触后肌动蛋白骨架与谷氨酸能突触注释。剔除角蛋白敏感性分析后差异表达不变但细胞骨架通路富集减弱。
Computational deconvolution reveals no evidence of immune cell proportion differences
CIBERSORTx对重叠子队列（63 sub1/43 sub2/41 sub3/69 TD）反卷积，未见亚组或ASD-TD间免疫细胞相对比例差异，说明蛋白信号非细胞组成偏移所致。
Cytoskeletal processes across blood proteomic studies
横向比对7项既往血液研究，仅KRT14与本研重叠于干血斑，但GO层面一致富集细胞骨架/肌动蛋白/中间丝组织（GO:0005200/0007010/0045109等），血浆血清干血斑PBMC多样本类型重现，染色质重塑未在外周既往研究重现。
Differentially expressed proteins correspond to autism risk genes
39 DEP中7个映射SFARI基因（ACTB、AHDC1、ATXN2、H3-3B、KMT2B、MACF1、UIMC1），Fisher精确检验OR=3.09、p=0.01，AHDC1（Eagle 14.25，34报）、ACTB（11报）为高置信综合征型。
Peripheral differentially expressed proteins partially overlap with autism brain proteomic datasets
与Fatemi等尸脑小脑蚓部（cerebellar vermis，CV）及背外侧前额叶（dorsolateral prefrontal cortex，DLPFC）数据比，MACF1、KRT9/14/1、DDX17、ARPC2、DPYSL5共7个重叠，角蛋白因质谱污染需谨慎。
讨论部分总结
研究人员指出PBMC蛋白网以ACTB为中心联结细胞骨架与染色质重塑，后者在T细胞活化中与染色质可及性协调变化，免疫活化可反映神经发育通路交集；亚组异质性由RCOR1等染色质复合物及Tcr-alpha等贡献，非单一 biomarker 驱动。局限包括反卷积不捕绝对细胞数/功能态、未设其他神经发育病对照、亚组定义与相关性同队列探索、角蛋白污染可能放大细胞骨架信号。意义在于提供微创外周分层线索，但需独立队列靶向验证。
结论翻译
PBMC蛋白质组学特征识别出与该发现队列中ASD诊断及临床异质性相关的分子签名。探索性网络分析突出细胞骨架组织与染色质重塑相关蛋白，支持进一步评估外周蛋白质组学作为探究ASD生物学及生物学知情患者分层的工具。
