倒垂茄（Solanum retroflexum Dunal）植株再生体系与根癌农杆菌介导稳定遗传转化方法的建立

《In Vitro Cellular & Developmental Biology - Plant》：Development of plant regeneration and stable Agrobacterium tumefaciens–mediated transformation methods for Solanum retroflexum Dunal

　　

倒垂茄在非洲、中国、印度及印度尼西亚等地兼作果菜与叶菜栽培，但因遗传与基因组资源有限，仍属未被充分利用作物。为借助新育种技术推进基因功能研究以实现品种改良，研究人员建立了高效的植株再生与根癌农杆菌（Agrobacterium tumefaciens）介导转化体系。以子叶与下胚轴外植体在添加0.5 mg L?1玉米素（zeatin）的MS（Murashige and Skoog）盐基培养基上测试再生，两类外植体再生率均达100%，但子叶产生完整植株数多于下胚轴。转化实验中，子叶外植体感染携带pJL33双元载体（含GFP报告基因与nptII选择标记）的根癌农杆菌AGL1株。共培养后先以75.0–400.0 mg L?1卡那霉素筛选，即便400.0 mg L?1仍出现大量逃逸；因nptII同时赋予G418抗性，后续测试25.0–150.0 mg L?1 G418，荧光显微镜与PCR分析表明25.0 mg L?1 G418下转化效率最高（88%）且逃逸最少。流式细胞术检测再生、转基因及野生型植株倍性，确认倍性稳定。优化筛选培养基促成了高效稳定转化系统，可支撑倒垂茄作物改良。

研究背景与立项依据：倒垂茄（Solanum retroflexum Dunal）为茄科茄属Morelloid支系四倍体（2n=4x=48）多年生至一年生植物，在非洲、中国、印度及印尼等地作为果叶兼用蔬菜，富含抗氧化物、黄酮、酚类及维生素，但受限于遗传与基因组资源匮乏，长期被列为未充分利用作物（underutilized crop）。尽管基因编辑与遗传工程可改良其产量稳定性、株型、果实均一性及抗逆性，该物种此前缺乏离体再生与遗传转化平台，无法开展功能基因组研究。研究人员由此首次系统建立倒垂茄子叶离体再生与根癌农杆菌介导稳定转化体系，为后续基因功能解析与分子育种提供基础工具。该文发表于《In Vitro Cellular & Developmental Biology - Plant》。

主要关键技术方法：研究人员以美国农业部ARS种质资源单位提供的倒垂茄种子（PI 68841001 SD）为材料，经表面消毒后于MS培养基离体萌发获得8–9天苗；取子叶与下胚轴外植体在含0.5 mg L^?1 zeatin的0.5Z培养基诱导愈伤与芽分化，筛选高再生外植体；选用根癌农杆菌AGL1株携带pJL33双元载体（CaMV35S驱动sGFP(S65T)与nptII）侵染子叶，共培养后分别用卡那霉素与G418梯度筛选，以未侵染外植体作正负对照；转化植株经GFP荧光镜检、nptII基因PCR（预期735 bp）验证；倍性采用流式细胞术（DAPI染色，Attune NxT）以番茄二倍体、倒垂茄四倍体野生型为参照判定。

研究结果：

离体种子萌发与植株再生：表面消毒种子于萌发培养基约75%发芽，8–9天取子叶与下胚轴接种0.5Z培养基，1周切口处形成紧实绿色愈伤，5周出芽，生根培养基无外源激素即生根，移栽温室成活100%。子叶与下胚轴再生率均100%，但子叶单外植体成苗数更高，故选子叶用于转化。

根癌农杆菌介导子叶转化：卡那霉素75–400 mg L^?1下再生率随浓度升至400 mg L^?1仍达80%，但GFP阳性转化效率仅43%–67%且高浓度仍有大量GFP阴性“逃逸苗”，PCR证伪nptII，提示卡那霉素筛选在该四倍体茄种中被局部中和或残留菌保护；改试G418，75–150 mg L^?1完全抑制再生，25、40、50 mg L^?1中25 mg L^?1再生率与转化效率最高（转化效率88%），逃逸最少，ANOVA与Tukey检验显示G418浓度效应极显著（p<2e-16）。

GFP表达与分子鉴定：GFP信号在卡那霉素筛选下10天可见，G418筛选下18–20天可见，持续至温室株叶、花、花粉、浆果及种子；T0株nptII PCR均扩出735 bp，野生型阴性；T0（25 mg L^?1 G418系）自交T1代15株荧光显微镜检GFP见于叶、花、花粉、果、种，证实稳定遗传。

流式细胞倍性分析：以番茄二倍体（2C）与倒垂茄野生型四倍体（4C）为基准，再生非转化株与转基因株G1峰均落于4C位置，偶见8C G2峰，无倍性漂移，证明组织培养与转化流程未诱发倍性变异。

讨论与结论翻译：据研究人员所知，本文首次报道倒垂茄子叶离体再生及根癌农杆菌介导转化。方法论显示抗生素G418较卡那霉素能更高效获得转基因株且逃逸更少；流式细胞术证实离体再生与转基因株倍性未变。上述发现为这一未充分利用作物倒垂茄的进一步育种、基因编辑及功能基因组研究奠定基础。