《Journal of Chromatography A》：Optimization and validation of a two-step extraction dispersive liquid–liquid microextraction (UA-DLLME) method for the determination of 17 antibiotics in influent wastewater
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DLLME（分散液液微萃取）是一种简单、快速且低成本的样品净化与分析物预浓缩方法。研究人员开发了一种两步超声辅助分散液液微萃取（UA-DLLME）方法，用于测定进水废水中的17种抗生素。采用逐因子优化方法对萃取条件进行了优化。该DLLME方法得到充分验证并应用
DLLME（分散液液微萃取）是一种简单、快速且低成本的样品净化与分析物预浓缩方法。研究人员开发了一种两步超声辅助分散液液微萃取（UA-DLLME）方法，用于测定进水废水中的17种抗生素。采用逐因子优化方法对萃取条件进行了优化。该DLLME方法得到充分验证并应用于进水废水。基于配对t检验（paired t-test），所开发方法显示出与固相萃取（SPE）程序相当的结果。
**论文解读：两步超声辅助分散液液微萃取（UA-DLLME）方法同时测定进水废水中17种抗生素的优化与验证**
**研究背景与问题**
抗生素的发现是现代医学的里程碑，但广泛使用导致了抗菌素耐药性（AMR）这一新威胁。抗生素进入人体后，部分以原形或代谢物形式通过尿液排泄，进入污水系统，最终汇集至污水处理厂（WWTPs）。污水流行病学（WBE）通过对污水成分的分析，可监测人群健康与药物使用情况。然而，废水基质复杂，抗生素浓度极低，需采用高灵敏度分析技术（如液相色谱-串联质谱，LC-MS/MS）并结合有效的预处理和预浓缩步骤。目前最常用的预处理方法是固相萃取（SPE），但SPE需大量样品体积、高成本耗材且耗时。直接进样法虽简单，但仅适用于高浓度分析物，且易引入基质干扰。新兴微萃取技术如均相液液微萃取（HLLME）、织物相吸附萃取（FPSE）和旋转纸盘（RPD）等虽性能良好，但依赖特殊材料或溶剂，在常规实验室中不易获得。相比之下，分散液液微萃取（DLLME）在简单性、快速性和低溶剂消耗间取得良好平衡，且所需试剂基础。尽管已有研究将DLLME用于水样中抗生素分析，但大多集中于有限种类或较简单基质（如地表水、出水废水），而针对进水废水这一复杂基质中多类别（大环内酯类、磺胺类、氟喹诺酮类、林可酰胺类、硝基咪唑类）抗生素的同时测定研究尚属空白。为此，本研究旨在优化并验证一种超声辅助DLLME（UA-DLLME）方法，用于同时测定污水处理厂进水废水中17种不同类别的抗生素。新意在于多类别同时测定、应用于复杂基质、无需特殊材料或先进萃取介质，并采用系统逐因子优化。
**研究概述与结论**
研究人员开发并充分验证了一种两步UA-DLLME方法，结合LC-MS/MS分析，成功应用于来自希腊Psyttalia污水处理厂的实际进水废水样品。通过逐因子优化（OFAT）方法，确定了最佳萃取条件：萃取溶剂为氯仿，分散溶剂为乙腈，样品体积5 mL，pH分两步（先调至9，再调至2），氯化钠浓度1%（w/v），超声时间5分钟。方法验证结果表明，线性良好（决定系数R2>0.98），回收率大多在80-120%范围内，精密度（RSD<20%），检测限（LOD）和定量限（LOQ）满足分析要求。实际样品分析中，17种抗生素中有15种被检出，浓度范围为2.6-2819 ng/L，其中大环内酯类（尤其是克拉霉素）浓度最高，与冬季呼吸道感染高发相符。与经典SPE方法相比，基于配对t检验显示两种方法无显著差异，而DLLME方法更快速（约1.5小时 vs SPE约3小时）、样品量更少（5 mL vs 50 mL）、溶剂消耗更少，成本更低。该研究发表于《Journal of Chromatography A》，为废水抗生素监测提供了一种高效、经济的替代方案。
**主要关键技术方法**
1. **两步超声辅助分散液液微萃取**：采用两步萃取，第一步在pH 9下进行，第二步在pH 2下进行，分别针对碱性分析物（如大环内酯类）和酸性/两性分析物（如磺胺类、氟喹诺酮类），合并萃取液后氮吹浓缩，复溶后过滤进样。
2. **液相色谱-串联质谱法（LC-MS/MS）**：使用UPLC系统耦合三重四极杆质谱，电喷雾正离子模式（ESI+），多反应监测（MRM）扫描，实现17种抗生素的分离与定量。
3. **逐因子优化（OFAT）**：依次改变分散溶剂类型、萃取溶剂类型、样品pH、样品体积、离子强度（NaCl浓度）、溶剂比例、超声时间等参数，以绝对回收率为响应指标，确定最优条件。
4. **方法验证**：评估基质效应、线性范围、准确度（回收率）、精密度（重复性和中间精密度）、检测限（LOD）、定量限（LOQ）及扩展不确定度。
5. **配对t检验**：将DLLME方法与参考SPE方法的结果进行统计学比较，验证等效性。样本来源：三个不同规模的污水处理厂（Psyttalia、Volos、Agios Nikolaos）的进水废水，用于验证；实际应用样品来自Psyttalia WWTP的8天连续24小时流量比例进水样品。
**研究结果**
**3.1 方法优化**
- **分散溶剂与萃取溶剂的选择**：通过比较乙腈（ACN）、甲醇（MeOH）、异丙醇（IPA）及ACN:MeOH混合液作为分散溶剂，氯仿和二氯甲烷（DCM）作为萃取溶剂，以绝对回收率为指标，发现ACN:氯仿组合效果最佳，50%的分析物回收率在80-120%范围内。
- **pH调节的选择**：考察pH 2、4、6.5、9。由于分析物pKa范围广（2.6-13.3），单一pH无法同时高效萃取所有化合物。两步萃取策略（先pH 9再pH 2）显著提高了磺胺类和氟喹诺酮类等酸性/两性分析物的总回收率，而对大环内酯类等碱性分析物损失可忽略。
- **样品体积的选择**：比较5、7.5、10 mL，5 mL时平均回收率最高，尤其是地红霉素脱（9-）酮糖基阿奇霉素（descladinose azithromycin）回收率显著高于其他体积。
- **氯化钠用量的选择**：不加NaCl时无法形成两相。测试0.5%、1%、2%（w/v），0.5%不能稳定分相，1%与2%结果相当，选择1%以节省试剂。
- **分散溶剂与萃取溶剂比例的选择**：比较ACN:氯仿体积比1:1、3:2、2:3，1:1时平均回收率最高且分布最窄，确定为最优比例。
- **超声时间的选择**：超声2.5、5、10分钟，5分钟时平均回收率最高，10分钟时因超声释放更多基质大分子干扰而下降。
**3.2 方法验证**
- **基质效应（ME）**：所有化合物ME<100%，表明存在信号抑制。采用基质匹配校准曲线（加标废水曲线）有效补偿基质效应。
- **线性与检测限**：线性范围100-4000 ng/L，R2均>0.98。LOD范围3.6-123 ng/L，LOQ范围10.7-369 ng/L。磺胺嘧啶（sulfadiazine）LOQ最低（10.7 ng/L），地红霉素脱（9-）酮糖基阿奇霉素（descladinose azithromycin）LOQ最高（369 ng/L）。
- **准确度与精密度**：三个浓度水平（500、1000、2000 ng/L）的回收率大多在80-120%内，日内和日间精密度RSD均<20%。
- **扩展不确定度**：随浓度增加而降低，所有分析物<40%。
**3.3 实际样品应用**
- 对Psyttalia WWTP 2026年1月1-8日连续8天的进水废水分析，17种抗生素中15种被检出。马波沙星（marbofloxacin，兽用氟喹诺酮）和林可霉素（lincomycin，已被克林霉素替代）未被检出。检出浓度范围2.6-2819 ng/L。大环内酯类（尤其是克拉霉素，浓度1676-2819 ng/L）为主要类别，与冬季呼吸道感染高发一致。人口归一化日负荷（PNDLs）结果与希腊其他WWTP（如塞萨洛尼基）及欧洲WWTP（西班牙卡斯特利翁、英格兰西南部、奥斯陆等）的研究结果可比。
**3.4 DLLME方法与SPE方法的比较**
- 对同样品分别用DLLME和已发表SPE方法分析，配对t检验显示所有检出浓度高于LOQ的化合物的p值>0.05，表明两种方法无显著差异。DLLME在样品量（5 mL vs 50 mL）、溶剂消耗（2 mL ACN+2 mL氯仿 vs 12 mL MeOH+SPE柱）、操作时间（约1.5小时 vs 约3小时）上均更优，但DLLME的预浓缩因子较低，导致部分化合物（如地红霉素脱（9-）酮糖基阿奇霉素、磺胺甲噁唑、N4-乙酰磺胺甲噁唑）的LOD较高，但仍在实际样品中成功检出。
**讨论与结论总结**
**讨论部分**：研究人员讨论了两步pH调节策略的原理，即利用磺胺类（弱酸，pKa5-7）在酸性条件下质子化、氟喹诺酮类（两性，pKa1 5-6，pKa2 8-9）在酸性条件下增强萃取，而大环内酯类（碱性，pKa8-10）在碱性条件下中性形式利于萃取，两步萃取综合了不同pH下的优势，总回收率提升。方法验证中，基质效应表现为抑制，但基质匹配校准曲线有效校正。实际样品中未检出马波沙星和林可霉素，符合预期（兽用或临床使用减少）。克拉霉素浓度最高，与冬季呼吸道感染高发一致。与希腊及欧洲其他研究对比，结果可比，差异归因于服务人口、流量及采样季节。与SPE比较，DLLME在时间、成本上显著优势，但检测限较高，适用于常规监测，超痕量分析需进一步优化。
**研究结论部分**（翻译原文4. CONCLUSIONS）：
本研究开发并充分验证了一种DLLME方法，用于同时测定进水废水样品中属于不同类别的17种抗生素。该方法与基于SPE的其他方法相比，展现出众多优势，包括简单性、快速性和成本效益。尽管SPE是一种成熟的方法，但它伴随材料的高成本且应用于大量样品时耗时。所提出的DLLME方法成功结合了这些优点，同时提供与SPE相当的回收率，证明了其作为常规废水分析可靠替代方案的潜力。经发现最有效的方法包括两个萃取步骤，在整个过程中将pH调节至两个不同值，从而提高了酸性和碱性分析物的回收率。对该方法的性能特性进行了适用性评估。此外，该方法成功应用于Psyttalia污水处理厂进水废水样品的分析。结果随后与在相同条件下对相同样品进行分析所得结果进行了比较，配对t检验显示无显著差异。
