《Advanced Science》：Neuropeptide Y—Graphene Oxide Complexes Inhibit Amygdala NPY-Receptor Expressing Glutamatergic Pathways and Selectively Remove Aversive Memory In Vivo
编辑推荐：
治疗需求调节脑回路突显了石墨烯基材料（GBMs）作为一种新兴工具来设计针对神经疾病的特异性干预。在此背景下，氧化石墨烯（GO）纳米片提供了新的药物递送策略，以选择性到达神经细胞和信号网络。为了复合和运输神经肽Y（NPY），研究人员将GO工程化为GO:NPY，并
治疗需求调节脑回路突显了石墨烯基材料（GBMs）作为一种新兴工具来设计针对神经疾病的特异性干预。在此背景下，氧化石墨烯（GO）纳米片提供了新的药物递送策略，以选择性到达神经细胞和信号网络。为了复合和运输神经肽Y（NPY），研究人员将GO工程化为GO:NPY，并研究了其递送到杏仁核（一种介导恐惧记忆反应的结构）时在调节NPY阳性突触通路中的兴奋性神经传递中的活性。首先，体外实验表明，GO:NPY通过NPY受体特异性和选择性地抑制谷氨酸释放并抑制突触增强。在焦虑症大鼠模型中，当注射到杏仁核时，GO:NPY通过特定突触通路中NPY受体的激活抑制了情境恐惧记忆反应。这种易于调节的基于GBM的纳米平台有望在共同递送载体方面取得进展，保留治疗特定病理状况所需的突触特异性。
**研究背景与问题**
神经疾病（如创伤后应激障碍（PTSD））的治疗需要精准调控特定脑回路，而石墨烯基材料（GBMs）因其独特的二维结构和可修饰性，成为新兴的工程化干预工具。氧化石墨烯（GO）纳米片具有纳米级尺寸、大比表面积和丰富的化学功能基团，可负载生物活性分子并靶向神经系统。然而，现有GO递送系统虽能进入中枢神经系统（CNS），但缺乏对特定突触通路的选择性调节能力。神经肽Y（NPY）是一种内源性神经调质，通过激活NPY受体（Y1、Y2）抑制谷氨酸能突触传递，在焦虑和恐惧记忆中发挥关键作用。但直接递送NPY易被降解，且难以精准靶向特定环路。为此，研究人员开发了非共价复合物s-GO:NPY，旨在利用GO纳米片作为载体，将NPY递送至杏仁核（LA）中表达NPY受体的谷氨酸能通路，选择性消除恐惧记忆而不影响焦虑行为。该研究发表在《Advanced Science》。
**主要关键技术方法**
1. **非共价复合物制备与表征**：采用医学级小尺寸氧化石墨烯（s-GO，横向尺寸<1 μm）与NPY通过pH调节和温和混合形成非共价复合物，利用超滤离心（100 kDa MWCO）去除未结合NPY。通过扫描电子显微镜（SEM）和原子力显微镜（AFM）表征形态，拉曼光谱、X射线光电子能谱（XPS）和X射线衍射（XRD）验证NPY吸附，动态光散射（DLS）和Zeta电位评估稳定性（>60天），高效液相色谱（HPLC）监测NPY脱附。
2. **体外电生理记录**：采用全细胞膜片钳技术，在离体海马和杏仁核神经元培养中（取自Wistar大鼠，出生后2-3天或7-10天），记录自发性兴奋性突触后电流（EPSCs），评估NPY和s-GO:NPY对谷氨酸释放的影响，并利用化学长时程增强（cLTP）模型检测突触可塑性调节。
3. **体内行为学与神经示踪**：利用成年雄性Wistar大鼠（n=48）建立PTSD模型（暴露于猫嗅味项圈），通过立体定位注射将复合物递送至杏仁核侧核（LA）。采用回避箱评估情境恐惧记忆（头伸出行为），高架十字迷宫（EPM）评估焦虑行为，旷场（OF）评估运动能力。通过逆行示踪剂Fast Blue标记LA投射至腹外侧导水管周围灰质（vlPAG）和腹内侧下丘脑（VMH）的神经元，结合免疫荧光检测NPY Y1受体表达。
**研究结果**
**2.1 非共价s-GO:NPY复合物的工程化**
通过优化质量比（s-GO:NPY=10:4）制备稳定复合物。SEM和AFM显示s-GO纳米片形态保持完整（横向尺寸~121 nm，厚度1-2 nm），XPS中N1s峰的出现证实NPY成功吸附，XRD中2θ峰从11.1°移至9.5°表明肽插入层间。DLS显示尺寸~200 nm，Zeta电位-50 mV，60天内稳定；HPLC和XPS证实NPY在42天内无显著脱附，储存2年仍保持载量。TNF-α检测排除内毒素污染。
**2.2 s-GO:NPY通过激活NPY受体减少谷氨酸能传递**
在离体海马培养神经元中，s-GO:NPY（10 μg/mL GO，1 μM NPY）与游离NPY同等程度地降低EPSC频率（归一化至0.56±0.11 vs 0.49±0.08）和幅度（0.80±0.13 vs 0.71±0.11），洗脱后部分恢复。加入Y1和Y2受体拮抗剂（BIBO3304和BIIE0246，各30 nM）后，s-GO:NPY的抑制作用消失，表明其通过NPY受体发挥生物活性。
**2.3 s-GO:NPY复合物阻止杏仁核神经元突触增强**
在离体杏仁核培养中，cLTP诱导后EPSC幅度显著增加（归一化至1.63±0.13），而s-GO:NPY或NPY预处理（5 min）完全阻止此增强（幅度分别为1.03±0.14和1.07±0.04），频率无显著变化。表明s-GO:NPY通过下调谷氨酸传递抑制突触可塑性。
**2.4 LA注射s-GO:NPY选择性减少恐惧记忆相关行为**
在PTSD大鼠模型中，LA注射s-GO:NPY或NPY显著减少情境恐惧记忆（头伸出行为：F(3,20)=12.75, p<0.001），而高架十字迷宫显示焦虑行为（开放臂时间）未受影响，旷场运动能力无差异。逆行示踪证实LA-vlPAG通路（参与恐惧反应）表达NPY Y1受体，而LA-VMH通路（参与焦虑）不表达。Y1受体拮抗剂BIBO3304（200 pmol）或乱序NPY复合物（s-GO:NPYscr）预处理均消除s-GO:NPY的恐惧记忆抑制效果，证明其特异性。
**讨论与结论**
研究人员发现，s-GO:NPY复合物保留了NPY激活Y受体的能力，通过靶向LA-vlPAG（NPY受体阳性）通路选择性调节恐惧记忆，而不影响LA-VMH（NPY受体阴性）通路介导的长期焦虑行为。与游离s-GO不同，复合后s-GO本身失去调节谷氨酸释放的活性，NPY受体拮抗剂和乱序肽实验进一步排除了非特异性效应。虽然当前实验无法区分NPY是从复合物释放还是以结合形式发挥作用，但结果支持NPY主要与s-GO结合状态下发挥生物活性。该研究首次证明，基于非共价吸附的纳米片递送系统可在体内精准靶向表达特定受体的CNS通路，为开发靶向神经疾病（如PTSD）的智能治疗平台提供了新策略。
**结论翻译**：总之，基于纳米片的运输系统，其中肽可以非共价吸附，能够靶向体内表达特定受体的中枢神经系统细胞/通路。尽管原始的s-GO先前被报道本身能调节谷氨酸能突触前释放，但当与大分子复合后，这种纳米材料显然失去了这种生物活性，增强了其作为中枢神经系统药物递送平台的潜力。事实上，这与一项初步研究中GO与肽共价结合的结果一致。这一假设进一步得到以下观察的支持：在NPY受体拮抗剂存在下，s-GO:NPY的活性被抑制，从而排除了复合物任何潜在活性归因于s-GO本身的可能。
