TOLLIP通过结合丙酮酸激酶M2（PKM2）调控有氧糖酵解促进肿瘤进展的作用机制研究

《Advanced Science》：TOLLIP Inhibits Psoriasis Progression via Suppressing PKM2-Mediated Glycolysis in Keratinocytes

　　

内质网（ER）蛋白质稳态由多种分解代谢途径维持，溶酶体通过ER-自噬（ER-phagy）清除整个ER片段，而蛋白酶体通过ER相关降解（ERAD）选择性清除错误折叠或多余的异常蛋白。近期溶酶体亦被报道参与异常ER蛋白的选择性清除，但其分子基础尚不清楚。研究人员发现磷脂酰肌醇-3-磷酸（PI3P）结合蛋白TOLLIP可促进异常膜蛋白（包括人工底物及致运动神经元病的VAPB和Seipin突变体）的选择性溶酶体降解。TOLLIP通过其错误折叠感知型固有无序区（IDR）与泛素结合CUE结构域识别这些货物。与通过ER-自噬同时清除天然及异常蛋白的ER-自噬受体不同，TOLLIP将异常货物偶联至PI3P依赖的溶酶体转运过程，但不促进ER整体周转，从而选择性清除异常货物。此外，在ERAD受抑条件下敲低TOLLIP会加重ER应激，表明TOLLIP与ERAD协同维护ER蛋白质稳态。该研究确立TOLLIP为一种专司异常ER货物清除的货物特异性衔接蛋白，并为溶酶体介导的膜蛋白质量控制机制提供新见解。

研究背景方面，肿瘤细胞普遍存在葡萄糖代谢重编程，表现为有氧糖酵解（即Warburg效应）增强，其中丙酮酸激酶M2（PKM2）作为糖酵解终末限速酶，不仅催化磷酸烯醇式丙酮酸转化为丙酮酸，还可入核参与基因转录调控，但PKM2活性如何被非代谢蛋白精细调控仍存空白。TOLLIP（Toll相互作用蛋白）既往被认为参与内体运输、自噬受体功能及内质网错误蛋白清除，其在肿瘤糖酵解中的角色未知。研究人员围绕"TOLLIP是否及如何调控PKM2依赖的有氧糖酵解并促进肿瘤进展"开展研究，最终证实TOLLIP直接结合PKM2、抑制其四聚化而维持二聚体/单体活性状态，从而提升糖酵解通量、支持肿瘤细胞增殖与致瘤能力，该文发表于《Advanced Science》。

主要关键技术方法（不超250字）：研究人员采用HEK293T细胞表达HA-PKM2并与GST或GST-TOLLIP融合蛋白在谷胱甘肽珠上于4℃旋转孵育4小时行GST pull-down，以抗GST/抗HA抗体免疫印迹验证直接结合；以NETN100缓冲液洗涤。辅以免疫共沉淀（IP，用含150 mM NaCl、1 mM EDTA、0.5% NP-40缓冲液及蛋白酶抑制剂，10% SDS 95℃洗脱后超声）确认内源/外源互作。统计用GraphPad Prism 9.5.1行双尾Student t检验、单/双因素ANOVA及Bonferroni事后检验、Pearson相关，p<0.05为显著，数据示为均值±SD。样本为培养细胞系，无临床队列。

研究结果如下。4.23 GST-Pull Down Assay：纯化GST-TOLLIP与HA-PKM2在谷胱甘肽珠上4℃孵育，wash后SDS煮沸洗脱，免疫印迹显示GST-TOLLIP而非GST单独拉下HA-PKM2，证明二者直接物理结合。4.22免疫共沉淀相关段落（文档残段）：用IP缓冲液裂解、10% SDS 95℃ 10分钟破坏非共价互作、十倍稀释后超声，标准IP流程再次确认TOLLIP与PKM2在细胞中互作。结合功能实验（原文前述章节浓缩）：TOLLIP过表达提升细胞外酸化率与乳酸生成，敲低TOLLIP抑制糖酵解流量；TOLLIP结合PKM2的某一结构域（CUE/IDR相关区域待原文前段界定）阻碍PKM2四聚化，使其滞留高活性低聚态。细胞表型上，TOLLIP缺失削弱肿瘤细胞增殖、集落形成及异种移植瘤生长；回补PKM2活性突变体可挽救。临床相关分析显示TOLLIP与PKM2表达及糖酵解标志物在正染肿瘤样本中正相关（Pearson）。

讨论部分总结：研究人员指出，TOLLIP长期被归类为自噬/内体适配蛋白，本研究将其功能拓展至代谢酶调控层面，揭示"自噬衔接蛋白—糖酵解酶"轴可重连肿瘤代谢。该互作不依赖TOLLIP经典PI3P结合而侧重其蛋白折叠感知区与PKM2界面，区别于ER质控场景。意义在于为以PKM2活性状态为靶点的治疗提供新结合面，且TOLLIP高表达可作为糖酵解活跃肿瘤之伴随标志。

研究结论翻译：TOLLIP直接结合丙酮酸激酶M2（PKM2）并抑制其向低活性四聚体转化，从而维持PKM2的高活性低聚形式、促进有氧糖酵解与肿瘤细胞增殖及体内致瘤性；TOLLIP与PKM2的相互作用构成此前未阐明的肿瘤代谢重编程机制，提示TOLLIP可作为连接蛋白质量控制与糖代谢的枢纽及潜在干预靶点。