内皮YAP信号促进小鼠脊髓损伤后血脊髓屏障修复

《Advanced Science》：Endothelial YAP Signaling Promotes Blood-Spinal Cord Barrier Repair in Mice After Spinal Cord Injury

　　

脊髓损伤（SCI）后，血脊髓屏障（BSCB）被破坏，内皮细胞作为BSCB的关键组分，通过增殖和重塑维持屏障完整性。然而，SCI后BSCB重塑的分子机制仍不清楚。在此，研究人员揭示Yes-associated protein（YAP），即Hippo信号通路的主要下游效应器，促进小鼠SCI后内皮增殖和BSCB修复。首先，研究人员发现SCI后YAP在内皮细胞中显著上调并激活。内皮YAP敲除（YAP^TEK-cre/ERT2-CKO小鼠）损害了内皮增殖、内皮-星形胶质细胞终足重组和紧密连接（TJ）完整性，从而加重BSCB破坏并损害SCI后BSCB重塑和运动功能恢复。机制上，内皮YAP依赖的BSCB修复与SCI后血管生成素-1（ANGPT1）表达和PI3K/AKT通路激活相关。在体外，外源性ANGPT1处理通过PI3K/AKT信号减轻了YAP缺乏诱导的内皮增殖抑制和内皮屏障破坏。最后，YAP信号激活部分缓解了SCI诱导的BSCB破坏，最终改善运动功能恢复。总之，这些结果将内皮YAP信号确定为与ANGPT1/PI3K/AKT通路相关的BSCB重塑的关键调控因子，并为SCI提供了潜在的治疗靶点。

**论文解读：内皮YAP信号通过ANGPT1/PI3K/AKT通路促进小鼠脊髓损伤后血脊髓屏障修复**

**研究背景与问题**
脊髓损伤（SCI）是一种严重的中枢神经系统创伤，常导致永久性运动、感觉及自主神经功能障碍，给社会带来沉重负担。SCI后，血脊髓屏障（BSCB）的破坏是继发性损伤的核心驱动因素之一。BSCB由脊髓微血管内皮细胞、紧密连接（TJ）蛋白、基底膜及血管周围胶质细胞构成，其完整性对维持中枢神经系统稳态至关重要。损伤后，BSCB通透性增加导致炎症细胞浸润、神经毒性因子进入实质，加剧神经炎症和神经元丢失。尽管已知血管内皮生长因子（VEGF）、Wnt/β-catenin和PI3K/AKT等信号通路参与内皮屏障稳定和血管再生，但调控BSCB修复的关键分子机制仍不清楚。Yes-associated protein（YAP）作为Hippo信号通路的下游转录共激活因子，在血管系统中可响应生物力学和炎症刺激，促进内皮细胞增殖、血管新生和屏障稳定。然而，YAP是否参与SCI后BSCB修复及其具体机制尚属空白。为此，研究人员开展了本研究，旨在阐明内皮YAP信号在SCI后BSCB重塑中的作用及分子机制。

**主要技术方法**
研究人员利用公开的单细胞RNA测序（scRNA-seq）数据集（GSE234774，来自Tabulae Paralytica图谱）对YAP在脊髓细胞群中的表达进行初步分析。随后通过构建他莫昔芬诱导的内皮细胞特异性YAP条件敲除小鼠（YAP^TEK-cre/ERT2-CKO）及内皮细胞报告小鼠（TEK-tdTom），在小鼠脊髓挤压伤模型中开展研究。关键技术包括：Evans Blue（EB）外渗实验评估BSCB通透性；透射电镜（TEM）观察紧密连接超微结构；Basso Mouse Scale（BMS）评分和运动学步态分析评价运动功能恢复；免疫荧光、Western blot和qRT-PCR检测蛋白及mRNA表达；bulk RNA测序结合scRNA-seq数据筛选差异基因；体外培养人脐静脉内皮细胞（HUVECs），通过siRNA敲低YAP并结合重组ANGPT1处理验证细胞自主机制。

**研究结果**
**2.1 内皮YAP上调并激活，其敲除加重SCI后BSCB破坏**
通过scRNA-seq分析发现，YAP在内皮细胞中高表达；Western blot和免疫荧光证实SCI后YAP蛋白在内皮细胞中显著上调并出现核转位。YAP^TEK-cre/ERT2-CKO小鼠在SCI后7天表现出EB外渗增加、TJ蛋白ZO-1和Occludin表达降低、TJ超微结构缩短和增宽，表明内皮YAP缺失加重了BSCB破坏。

**2.2 内皮YAP缺失损害运动功能恢复，加剧神经元丢失和轴突退变**
BMS评分和运动学分析显示，YAP^TEK-cre/ERT2-CKO小鼠后肢运动恢复显著受损；Nissl、Oil Red O及NeuN、NF染色显示病变面积扩大、神经元存活减少、轴突纤维减少，提示内皮YAP缺失导致继发性损伤加重。

**2.3 内皮YAP信号通过促进损伤诱导的内皮增殖参与BSCB血管重塑**
利用TEK-tdTom小鼠进行谱系示踪，发现SCI后28天YAP^TEK-cre/ERT2-CKO小鼠tdTom⁺血管面积和长度减少；Ki67染色显示SCI后7天YAP缺失小鼠内皮细胞中增殖细胞比例显著降低，表明YAP是损伤诱导内皮增殖和血管重塑所必需的。

**2.4 内皮YAP缺失抑制星形胶质细胞-内皮细胞重组并降低星形胶质细胞AQP4表达**
GFAP和tdTom共染显示，YAP^TEK-cre/ERT2-CKO小鼠在SCI后3-28天星形胶质细胞终足覆盖血管的能力受损；AQP4（水通道蛋白4）在tdTom⁺血管周围的表达显著降低，提示内皮YAP是星形胶质细胞-血管界面重建的关键调控因子。

**2.5 内皮YAP缺失抑制ANGPT1表达和PI3K/AKT信号**
Bulk RNA-seq结合scRNA-seq分析筛选出94个YAP相关的损伤差异基因，包括Tjp1（ZO-1）和Aqp4下调、Angpt2上调；GO和KEGG分析显示基底膜结构和PI3K/AKT通路富集。qRT-PCR、Western blot和免疫荧光证实YAP^TEK-cre/ERT2-CKO小鼠中HIF-1α和ANGPT1表达降低，p-PI3K和p-AKT水平下降，表明内皮YAP缺失与ANGPT1/PI3K/AKT信号抑制相关。

**2.6 ANGPT1通过PI3K/AKT信号在体外缓解YAP缺失诱导的内皮增殖抑制和屏障破坏**
在LPS刺激的HUVECs中，siRNA敲低YAP导致HIF-1α、ANGPT1、ZO-1和Occludin表达降低，p-PI3K/p-AKT减少；外源性ANGPT1处理（500 ng/mL，48 h）显著恢复ZO-1和Occludin表达、增强p-PI3K/p-AKT水平，并增加EdU⁺增殖细胞比例，证实ANGPT1是YAP的下游效应因子。

**2.7 药理抑制MST1/2激活YAP相关信号增强SCI后BSCB修复和功能恢复**
使用MST1/2抑制剂XMU-MP-1（1 mg/kg，腹腔注射，每2天一次）处理小鼠，SCI后7天EB外渗减少、TJ蛋白表达恢复、TJ超微结构改善；ANGPT1表达和PI3K/AKT信号增强；星形胶质细胞终足AQP4覆盖增加。BMS评分和运动学分析显示XMU-MP-1显著改善后肢运动恢复，并减少神经元丢失、促进5-HT能纤维穿过损伤区。

**讨论与结论**
讨论部分强调，内皮YAP是SCI后BSCB修复和神经血管重塑的关键协调因子。YAP在损伤后内皮细胞中被激活，通过促进内皮增殖、TJ稳定和星形胶质细胞-血管重组，限制继发性损伤并保护神经元。机制上，YAP依赖的BSCB修复与ANGPT1/PI3K/AKT信号通路相关，同时可能涉及与周细胞的旁分泌相互作用。研究还指出，药理激活YAP信号（如XMU-MP-1）可部分改善BSCB修复和功能恢复，但需注意XMU-MP-1的非内皮特异性作用及可能的YAP非依赖性效应。文章最后承认了研究的局限性，包括ANGPT1细胞来源未在体内直接证实、YAP可能调控其他转录程序、非内皮细胞YAP的贡献未明确等。

**结论翻译**：本研究表明，内皮YAP是SCI后BSCB恢复和神经血管重塑的关键调控因子。研究人员证实，损伤诱导的内皮YAP激活促进TJ稳定、内皮增殖和星形胶质细胞-血管协调重组，从而限制继发性损伤并保护神经元完整性。机制上，这些效应至少部分与ANGPT1/PI3K/AKT信号相关，将Hippo通路活性与损伤脊髓的血管稳定联系起来。重要的是，YAP的药理激活增强了BSCB修复并改善了功能恢复，强调了靶向内皮YAP信号在SCI中的治疗潜力。总之，这些发现揭示了内皮YAP信号在协调血管和神经修复过程中的先前未被认识的作用，并为创伤性SCI中开发以屏障为重点的治疗策略提供了机制框架。