《Journal of Pharmaceutical Sciences》：Single-use mixing systems for protein products: Evaluation of dissolution performance and mechanical stress
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生物药物产品的无菌灌装（fill & finish）涉及关键操作，如冷冻/解冻、混合、过滤和灌装。这些过程必须充分表征以理解其对产品质量的影响。虽然单次使用系统（single-use systems）提供了高效性和灵活性，但它们也引入了与无菌操作和生物制剂材料
生物药物产品的无菌灌装（fill & finish）涉及关键操作，如冷冻/解冻、混合、过滤和灌装。这些过程必须充分表征以理解其对产品质量的影响。虽然单次使用系统（single-use systems）提供了高效性和灵活性，但它们也引入了与无菌操作和生物制剂材料相容性相关的挑战。对于单元操作“混合”，设备配置各不相同，各有其独特的优势和局限性。在本研究中，研究人员系统地比较了两种使用药物原液（drug substance）瓶的单次使用混合系统的性能，这些系统配备了顶部安装叶轮（top-mounted impeller, TMM）、新型底部安装叶轮（bottom-mounted impeller, BMM）以及传统磁力搅拌器（magnetic stirrer, MS）。混合效率通过电导率（conductivity）变化以溶解时间（dissolution time）表示进行评估，并考察了放大参数，包括容器尺寸、填充体积和叶轮尖端速度（tip speed）。溶解时间取决于混合器类型，并与尖端速度和叶轮直径/瓶直径比呈负相关。BMM和TMM显示出持续更低的溶解时间，且面临的挑战少于MS，后者在某些配置下表现出混合质量不足。混合过程中的机械应力使用模型蛋白（model protein）进行评估，结果通过计算流体动力学（computational fluid dynamics, CFD）模拟得到验证。机械应力取决于混合器类型和填充体积，并对模型蛋白的产品质量产生不利影响，这种影响在较高填充体积时变得不那么明显。使用MS时对产品质量的不利影响通常比BMM更大且变异更多。这些发现为制剂和工艺开发科学家提供了数据驱动的指导，以选择适合生物药物制造和放大过程的混合技术。
**论文解读文章**
**研究背景与问题**
在生物制药行业中，单次使用（一次性）生物处理材料在制造过程中被广泛采用，尤其是在无菌灌装（fill & finish）操作中，它们消除了清洗和在线灭菌（cleaning and sterilization-in-place）程序及其相关验证，降低了交叉污染风险，并通过即插即用能力增强了操作灵活性。然而，单次使用系统也带来了挑战，包括需要满足可提取物/浸出物（extractables/leachables）的监管要求，以及控制内毒素和颗粒物污染。混合是生物药物产品制造中的关键单元操作，涉及赋形剂溶解、原液合并等，旨在确保物料均一性，同时最小化机械应力对产品质量的影响。不同混合器类型，如Rushton涡轮、斜叶桨和船用叶轮，会产生不同的机械应力。现有研究已评估了混合时间、机械应力对蛋白质稳定性的影响，例如Nakach等人系统研究了方形一次性容器中的混合时间，Gikanga等人探讨了底部安装混合器（bottom-mounted mixer, BMM）的设计对单克隆抗体（monoclonal antibody, mAb）产品质量的影响，Colombié等人评估了搅拌罐中溶菌酶的失活和聚集。然而，随着新型单次使用混合系统的出现，需要评估当前不同混合系统的挑战和局限性。因此，本研究旨在比较三种单次使用混合系统（顶部安装混合器TMM、底部安装混合器BMM和传统磁力搅拌器MS）在瓶配置中的混合性能和机械应力，为生物药物制造中的混合技术选择提供数据驱动指导。该论文发表在《Journal of Pharmaceutical Sciences》。
**主要技术方法**
研究人员采用电导率法监测氯化钠（NaCl）在水中溶解的溶解时间（dissolution time）以评估混合性能，涉及不同瓶尺寸（0.5、2、5、20 L）、填充体积和叶轮尖端速度（tip speed）。机械应力评估使用0.1 mg/mL溶菌酶（lysozyme）作为模型蛋白，在72±2°C下搅拌4小时，通过高效液相色谱（high-performance liquid chromatography, HPLC）测定剩余浓度并计算失活速率，同时通过视觉检查和HPLC峰面积变化评估蛋白质沉淀。计算流体动力学（computational fluid dynamics, CFD）模拟采用SolidWorks Flow Simulation软件，使用k-ε湍流模型和RANS方法，生成混合轮廓和剪切应力分布图。所有实验重复三次，统计分析使用多元线性回归模型（JMP软件）识别显著参数。样本来源为实验室配制溶液，无特定患者队列。
**研究结果**
**混合性能（Mixing performance）**
通过溶解固体NaCl在水中的溶解时间来评估三种混合器的混合性能。结果表明，BMM和TMM在测试条件下表现出比MS更快的溶解时间，且MS在不同配置下标准偏差较高。在20 L瓶中，MS在最大填充体积和最小尖端速度下未能溶解NaCl，表明混合不足。统计模型（R2=0.84）显示，混合器类型（仅BMM显著）、尖端速度和叶轮直径/瓶直径比（d
impeller/D
bottle）对溶解时间有显著影响。随着尖端速度增加，溶解时间缩短；较大的d
impeller/D
bottle比也对应更短的溶解时间。与MS相比，BMM的溶解时间平均减少42%，TMM减少58%。在相同尖端速度下，BMM表现优于MS，与TMM相当。
**机械应力测试（Mechanical stress testing）**
使用溶菌酶作为模型蛋白评估机械应力，通过监测剩余蛋白质浓度计算失活速率。结果表明，填充体积增加时，失活速率降低；在高填充体积（如5 L瓶中1.5 L）下，三种混合器与对照之间无显著差异。在可比配置下，BMM的失活速率始终低于MS。视觉检查和HPLC分析显示，MS配置中可见颗粒最多，BMM次之，TMM最少。失活速率与沉淀蛋白质分数呈指数相关。统计模型（R2=0.99）显示，混合器类型（BMM和MS）和填充体积对失活速率有显著影响。MS的失活率通常更高且更易变，BMM和TMM表现更优。
**计算流体动力学模拟（Computational fluid dynamics simulations）**
CFD模拟生成了混合轮廓和剪切应力分布图。MS在较小体积中表现出径向流动为主，角落存在死区，且流动方向缺乏一致性。BMM显示出轴向和径向混合，形成稳定的再循环回路，流动均匀且温和。TMM以切向流动为主，固定挡板破坏了圆形运动，促进了轴向混合和涡旋形成。剪切应力分布显示，MS在搅拌棒与瓶底接触点处有高剪切区，BMM在叶片尖端和瓶底附近有高剪切区，TMM在中心和中半径区域有较宽的剪切区。雷诺数计算表明，MS和BMM在大叶轮高转速下进入湍流区，而TMM始终处于湍流区。失活速率与剪切应力/体积比呈线性相关（R2=0.72）。
**讨论与结论**
讨论部分指出，混合性能受混合器类型、尖端速度和d
impeller/D
bottle比显著影响，BMM和TMM优于MS，尤其在高填充体积下MS出现混合不足问题。机械应力方面，MS导致更高的蛋白质失活和沉淀，这与其接触式设计及产生的死区、高剪切区域有关；BMM的非接触式设计减少了机械应力影响。填充体积增加时，单位体积界面面积减小，机械应力降低。CFD模拟结果支持了实验观察，但强调蛋白质不稳定性不能仅归因于剪切应力，而是多种因素（界面效应、空化等）共同作用的结果。
研究结论（Conclusion）部分翻译如下：为生物制药制造选择合适的混合系统仍然具有挑战性，在选择（单次使用）系统和该单元操作的工艺参数时，必须同时仔细评估混合性能以及与机械应力相关的产品质量影响。在本研究中，研究人员比较了生物制造中常用的瓶配置单次使用混合系统BMM、TMM和MS。MS在不同参数下始终表现出更长的溶解时间，且在高混合体积时面临技术挑战，而BMM和TMM表现出相当的性能，且MS和BMM可应用于非常低的混合体积。基于统计模型，混合性能取决于混合器类型、尖端速度和叶轮直径与瓶直径之比，但不取决于其他工艺或尺寸参数。混合器类型和填充体积被确定为影响模型蛋白（溶菌酶）产品质量（失活速率）的统计显著参数。研究人员报告称，在可比配置下，传统MS相比BMM具有更高的机械应力相关质量影响。在高填充体积下，三种混合器在此方面与对照相比无差异。CFD模拟进一步补充了混合性能以及机械应力测试结果。总之，这些发现为在生物制药制造中选择合适的单次使用混合系统以及评估潜在产品影响风险提供了方法。
