丙酮酸激酶M2上调与吉兰-巴雷综合征风险和免疫失调相关：来自孟德尔随机化和实验性自身免疫性神经炎模型的见解

《Brain and Behavior》：Pyruvate Kinase M2 Upregulation Is Associated With Guillain–Barré Syndrome Risk and Immune Dysregulation: Insights From Mendelian Randomization and the Experimental Autoimmune Neuritis Model

　　

该研究旨在探讨丙酮酸激酶M2（PKM2）在吉兰-巴雷综合征（GBS）发病机制中的潜在参与。方法：采用孟德尔随机化（MR）分析评估PKM2表达与GBS易感性之间的因果关系，并利用中介分析探索免疫细胞介导的途径。进一步使用GoDMC mQTL数据和GRT-qPCRWAS Data Hub图谱分析，检测PKM2甲基化与GBS风险之间的关联。为实验验证这些发现，研究人员通过P0_180–199肽免疫雄性C57BL/6小鼠（6–8周龄）建立实验性自身免疫性神经炎（EAN）小鼠模型，在疾病起始期（第8天）和高峰期（第16天）收集组织。采用Western blot、免疫组织化学、免疫荧光、流式细胞术以及H&E/勒克司坚牢蓝（LFB）染色评估PKM2表达动态、Th17/Treg（调节性T细胞）平衡及组织病理学变化。结果：MR分析显示，胫神经中PKM2表达升高与GBS风险增加显著相关（OR: 1.75–6.14，p < 0.05）。在EAN模型中，坐骨神经中PKM2表达呈时间依赖性增加（p < 0.01），主要定位于炎性浸润区域。机制研究表明，CD4⁺ T细胞中PKM2上调与促进Th17分化相关，表现为IL-17a和RORγt上调（p < 0.05），同时伴有Treg细胞减少（p < 0.01）。为进一步阐明上游表观遗传调控，研究人员利用GoDMC mQTL数据研究PKM2甲基化与GBS风险的关系。在四个选定的甲基化位点中，两样本MR分析表明cg24327132与GBS风险呈正相关（p < 0.05）。此外，GWAS Data Hub的分析显示，cg24327132在适应性免疫细胞（包括调节性T细胞、CD4⁺ T细胞和B细胞）中倾向于低甲基化（Beta ≈ 0–0.05），与固有免疫群体（Beta ≈ 0.10–0.20）在视觉上不同，提示该低甲基化状态的扰动可能使PKM2表达失调并促使GBS易感性。结论：PKM2上调与GBS风险和免疫功能障碍相关。PKM2甲基化可能是该关联的关键调控机制。PKM2可能是一个值得进一步治疗研究的机制靶点。

**论文解读文章**

**研究背景与问题**

吉兰-巴雷综合征（Guillain–Barré syndrome, GBS）是一种急性自身免疫性周围神经病，以周围神经和神经根的脱髓鞘及炎性细胞浸润为特征，是全球弛缓性瘫痪的最常见原因。约三分之一的GBS患者需入住重症监护室，而目前临床有效的治疗仅包括静脉注射免疫球蛋白和血浆置换，两者均价格昂贵且疗效有限。急性炎性脱髓鞘性多发性神经病（acute inflammatory demyelinating polyneuropathy, AIDP）作为GBS最常见的病理亚型，其发病机制仍不清楚，尤其是细胞免疫中的Th17细胞分化调控信号通路尚未明确。Th17细胞在分化或激活过程中表现出显著代谢重编程特征，其能量代谢从氧化磷酸化转向有氧糖酵解。丙酮酸激酶M2（pyruvate kinase M2, PKM2）作为糖酵解途径的最终限速酶，不仅通过催化糖酵解支持细胞增殖，还具有调控基因表达的能力。值得注意的是，PKM2对Th17细胞的代谢重编程和增殖并非必需，但T细胞特异性PKM2缺失可通过减少Th17细胞分化抑制Th17介导的炎症反应，且不影响Th1、Th2或iTreg细胞的分化。因此，PKM2作为关键的非代谢调控因子，在自身免疫介导的炎症中精细调节Th17细胞的分化和功能。然而，目前尚无研究探讨PKM2是否参与AIDP/GBS的发病机制。本研究旨在通过孟德尔随机化（Mendelian randomization, MR）分析和实验性自身免疫性神经炎（experimental autoimmune neuritis, EAN）模型，探索PKM2在GBS发病中的作用，论文发表在《Brain and Behavior》。

**主要关键技术方法**

研究人员采用两样本MR分析，利用GTEx Portal数据库的eQTL数据作为暴露（PKM2表达），FINNGEN数据库的GBS汇总统计数据（551例病例，491,583例对照）作为结局，以评估因果关系。中介MR分析整合了GWAS Catalog中731种免疫表型（包括B细胞、树突状细胞、成熟T细胞和单核细胞）的汇总数据。甲基化分析使用GoDMC mQTL元分析数据和EWAS Data Hub图谱。实验验证采用雄性C57BL/6小鼠（6–8周龄）通过P0_180–199肽免疫建立EAN模型，在第8天（疾病起始）和第16天（症状高峰）收集组织。技术方法包括Western blot、免疫组织化学、免疫荧光、流式细胞术、RT-qPCR以及H&E/勒克司坚牢蓝（LFB）染色。

**研究结果**

**3.1 MR分析确认坐骨神经中PKM2高表达与GBS风险显著相关**
通过以胫神经PKM2表达为暴露、GBS为结局的MR分析，多种MR方法（逆方差加权法IVW：OR=3.281，95%CI=1.753–6.140，p<0.001；加权中位数法：OR=4.398；简单模式法：OR=4.761）均显示遗传预测的PKM2表达与GBS风险呈显著正因果关系。敏感性分析（MR-Egger截距检验、Cochran's Q检验、留一法分析）未发现水平多效性或异质性，证实结果稳健。

**3.2 EAN的临床与病理特征**
EAN模型小鼠临床评分显著升高（p<0.01），跑步任务失败时间提前（p<0.05），后肢步宽进行性增加（p<0.01）。组织病理学上，H&E染色显示神经纤维波浪状扭曲及单核细胞浸润，LFB染色证实明显脱髓鞘，证实EAN模型成功建立。

**3.3 EAN坐骨神经中PKM2表达呈时间依赖性增加**
RT-qPCR和Western blot显示，坐骨神经中PKM2 mRNA和蛋白水平在疾病早期（第8天）和症状高峰期（第16天）逐渐升高（p<0.01）。免疫组织化学和免疫荧光进一步证实PKM2蛋白表达升高，且几乎局限于炎性细胞浸润区域，对照组小鼠坐骨神经中几乎无表达。

**3.4 免疫细胞在PKM2与GBS/EAN之间的潜在作用**
两步中介MR分析发现，HLA DR++单核细胞百分比和过渡性B细胞绝对计数对GBS具有保护效应，但中介效应未达统计学意义（p分别为0.121和0.243）。在EAN模型中，脾脏CD4⁺ T细胞中PKM2 mRNA表达随疾病进展显著升高，伴随IL-17a、IL-6和TGF-β mRNA上调；坐骨神经CD4⁺ T细胞中PKM2及Th17相关基因（IL-17a、IL-23、Rorα、Rorγt）转录水平显著升高（p<0.05）。流式细胞术显示脾脏中Th17细胞比例升高而Treg细胞比例降低（p<0.01），提示PKM2高表达通过促进Th17分化参与GBS/EAN发病。

**3.5 PKM2甲基化对GBS的影响**
利用GoDMC mQTL数据，对PKM2的四个甲基化位点进行两样本MR分析。cg23893460在IVW法中显示名义阳性关联（OR=1.29，p<0.001），但其他MR方法未复现。cg24327132在所有MR方法中均显示稳健且一致的阳性因果关联（IVW：OR=2.68，p<0.001；MR-Egger：OR=3.49，p=0.037；加权中位数法：OR=2.76，p<0.001；简单模式法：OR=2.90，p=0.027），且无水平多效性（p=0.568）或离群值影响。EWAS Data Hub分析显示，cg24327132在适应性免疫细胞（调节性T细胞、CD4⁺ T细胞、B细胞）中维持低甲基化状态（Beta≈0–0.05），与固有免疫细胞（单核细胞、树突状细胞、巨噬细胞，Beta≈0.10–0.20）形成对比，提示该低甲基化状态的扰动可能上调PKM2表达并增加GBS易感性。

**讨论与结论**

本研究首次通过MR分析建立胫神经PKM2表达升高与GBS易感性增加的因果关系，并利用EAN模型验证了PKM2在AIDP/EAN发病中的主动作用。PKM2表达从疾病起始到高峰期进行性增加，且免疫荧光显示其几乎仅存在于炎性细胞浸润区域，提示PKM2通过免疫细胞内在机制驱动疾病进展。中介MR分析虽未达到统计学显著，但HLA DR++单核细胞和过渡性B细胞作为潜在介质的发现为免疫调节作用提供了新见解。在EAN中，PKM2上调与Th17分化增强及Treg减少相关，且未观察到糖酵解相关基因的显著变化，提示PKM2可能通过非代谢机制（如核转位与STAT3相互作用）促进Th17分化。甲基化分析鉴定出cg24327132为与GBS风险稳健相关的甲基化位点，其在适应性免疫细胞中的低甲基化状态提示该位点受细胞类型特异性表观遗传编程，维持PKM2的转录许可状态。由于表观遗传异常具有可逆性，这些甲基化位点可能成为GBS表观遗传干预的候选靶点。研究局限性包括仅使用雄性小鼠、需进一步验证cg24327132的转录调控机制以及需通过T细胞特异性PKM2缺失或TEPP-46处理进行直接功能验证。

**研究结论**
PKM2上调与GBS风险和免疫功能障碍相关。特定CpG位点的PKM2甲基化可能是该关联的上游调控机制。这些发现将PKM2确定为未来功能和治疗研究的候选靶点，有待通过功能缺失和挽救实验进行直接验证。