《Molecular & Cellular Proteomics》：Simultaneous Spatial Mapping and Identification of C-Peptides Alongside Lipids in Mouse Pancreatic Tissues with nano-DESI Mass Spectrometry Imaging
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胰腺胰岛细胞分泌的肽类调节葡萄糖稳态，其失调可能导致代谢紊乱如糖尿病和胰腺疾病。研究人员使用纳米喷雾解吸电喷雾电离质谱成像（nano-DESI MSI）来识别和映射小鼠胰腺组织中的完整和截短C肽。除了常见的脂质和代谢物，研究人员检测到36个多重带电酸性肽，它们
胰腺胰岛细胞分泌的肽类调节葡萄糖稳态，其失调可能导致代谢紊乱如糖尿病和胰腺疾病。研究人员使用纳米喷雾解吸电喷雾电离质谱成像（nano-DESI MSI）来识别和映射小鼠胰腺组织中的完整和截短C肽。除了常见的脂质和代谢物，研究人员检测到36个多重带电酸性肽，它们在负离子模式下优先电离。利用组织上串联质谱（MS/MS）将其鉴定为完整的C肽亚型和多种截短变体，包括几个先前未报道的肽。通过MS/MS数据的分子网络分析，基于共享的碎裂模式将一些未鉴定物种归入C肽家族。离子图像显示截短肽的独特分布，化学梯度从β细胞延伸到胰岛周围腺泡细胞，提示它们在内分泌-外分泌通讯中的潜在作用。这些发现证明了nano-DESI MSI在识别和空间映射新型肽方面的能力，这对于理解它们在胰腺组织中的作用至关重要。
**论文解读：基于nano-DESI MSI的小鼠胰腺组织中C肽空间映射与鉴定研究**
**研究背景与问题**
胰腺胰岛中的β细胞分泌胰岛素和C肽，后者曾被视为胰岛素产生的惰性标志物，但近年研究证实C肽具有生物活性，参与血管和周围神经功能调节，并具有抗炎和细胞保护作用。C肽的截短变体（如C-末端缺失的多种形式）在胰岛细胞内被鉴定，但其在胰腺组织中的空间分布尚不清楚。由于胰岛体积微小（仅占胰腺约2%），传统光学显微镜难以区分不同C肽变体的定位。质谱成像（MSI）技术虽能实现无标记空间映射，但此前研究多采用正离子模式MALDI-MSI，需去除脂质以抑制离子抑制效应，且空间分辨率有限（约50 μm），仅能报告少数C肽的离子图像。研究人员旨在开发一种无需前处理、可直接在负离子模式下同时检测C肽与脂质的方法，以揭示完整和截短C肽在胰腺组织中的空间分布梯度，并探讨其在内分泌-外分泌通讯中的潜在作用。该研究发表在《Molecular 》。
**主要技术方法**
研究使用来自3–4月龄雄性C57BL/6小鼠的胰腺组织切片（18 μm厚），主要技术方法包括：
1. **纳米解吸电喷雾电离质谱成像（nano-DESI MSI）**：在负离子模式下直接分析未处理组织切片，采用9:1甲醇/水溶剂，以15 μm/s扫描速度、30 μm线间距获取质谱数据，同时检测肽和脂质。
2. **组织上串联质谱（on-tissue MS/MS）**：通过高能碰撞解离（HCD）对感兴趣区域（内分泌、外分泌、血管）中的肽进行碎裂，手动注释b、c、y离子及其脱水/脱氨类似物，鉴定完整和截短C肽。
3. **分子网络分析（GNPS）**：基于MS/MS谱图的余弦相似性构建分子网络，将未鉴定物种与已知C肽家族关联。
4. **免疫荧光显微镜（IF）**：使用抗胰岛素和抗胰高血糖素抗体标记β细胞和α细胞，作为空间配准的参考，并与nano-DESI MSI图像进行仿射变换配准。
样本来源为美国普渡大学IACUC批准的动物实验。
**研究结果**
**1. 利用nano-DESI MSI和IF显微镜鉴定与胰腺胰岛相关的脂质**
通过比较IF图像（胰岛素标记β细胞、胰高血糖素标记α细胞）与nano-DESI MSI离子图像，发现磷脂酰胆碱（PC）36:1、PC 36:2、PC 38:4、鞘磷脂（SM）d42:2和磷脂酰丝氨酸（PS）38:4在胰岛内富集，而溶血磷脂（如LPC 18:3、LPC 18:2、LPA 18:2等）在胰岛内信号极低或缺失。这些脂质可作为内源性胰岛标志物，简化后续实验流程。
**2. 鉴定胰腺肽的截短形式**
在负离子模式nano-DESI MSI中，直接检测到36个多重带电酸性肽，主要分布在胰岛及其周围。通过手动注释组织上MS/MS谱图，鉴定出完整C肽1（3121 Da）和C肽2（3133 Da），以及分别来自C肽1的4个截短变体和来自C肽2的10个截短变体（共14个截短肽），包括多个先前未报道的物种。所有肽均以多重去质子化形式出现，未见修饰形式。
**3. 基于MS/MS碎裂模式的分子网络**
利用GNPS经典分子网络分析，基于MS/MS谱图相似性（余弦相似度≥0.7，至少6个匹配片段离子），构建了包含完整C肽1/2及其截短变体的网络簇。C肽1和C肽2簇之间存在交叉连接（如共享b2?、c3?、b4?离子）。6个未鉴定物种（UK1–UK6）直接连接到已知截短C肽（如des-(26–31)-C肽2），基于共享片段离子（如c3?、b4?、b14-H2O2?）推测它们可能是截短C肽的修饰形式。
**4. 完整和截短C肽的空间分布**
离子图像显示，所有鉴定肽的信号在胰岛内增强，并向外分泌腺泡细胞延伸，但不同肽的化学梯度陡峭程度不同。例如，des-(22–29)-C肽1和des-(23–29)-C肽1等表现出陡峭梯度（严格局限于内分泌细胞），而des-(24–29)-C肽1、des-(25–29)-C肽1以及多数C肽2截短变体表现出较缓和的梯度，延伸到更远的胰岛周围腺泡组织。这表明C肽可能通过胞吐作用从β细胞运输到外分泌细胞，参与内分泌-外分泌通讯。
**5. 其他多重带电物种的空间分布**
未鉴定肽（包括UK1–UK6和其他非网络物种）也呈现不同的空间分布：UK1、UK3、UK4、UK5从内分泌区向胰岛周围组织扩散；UK2和UK6严格局限于胰岛内部。一个1444 Da肽完全局限于内分泌细胞，而3007 Da肽仅出现在胰岛周围腺泡组织，提示区域特异性分子组成。线轮廓分析证实，这些空间梯度差异并非由绝对丰度或检测阈值引起，而是反映了肽的特异性分布。
**讨论与结论**
**讨论部分总结**：先前研究虽通过LC-MS或MALDI-MSI鉴定了胰岛C肽，但缺乏原位空间映射。本研究通过负离子模式nano-DESI MSI直接从未处理组织切片中同时检测C肽和脂质，保留了组织化学背景。分子网络分析将未鉴定物种与C肽家族关联，为复杂肽数据集提供系统框架。空间梯度揭示了C肽从内分泌到外分泌的运输，提示其在内分泌-外分泌通讯中的潜在功能，可能与胰岛自身抗原呈递（如MHC-II结合）或免疫调节相关。不同肽的梯度差异可能反映功能分化。
**结论部分翻译**：本研究利用纳米解吸电喷雾电离质谱成像（nano-DESI MSI）的灵敏度，直接在小鼠胰腺组织中识别并空间映射内源性肽，包括先前未报道的物种。这些酸性肽仅在负离子模式nano-DESI MSI中以多重去质子化形式观察到，归因于C肽（已知来源于胰岛内胰岛素原）。研究人员获得了胰腺中36个肽物种的空间图谱。组织上串联质谱（MS/MS）实现了对完整C肽1和C肽2以及14个截短变体的可靠鉴定，揭示了胰岛内显著的肽异质性。通过将分子网络与空间分辨离子成像相结合，研究人员基于共享的MS/MS碎裂特征建立了完整、截短及未鉴定肽之间的结构关系。网络关联的未知物种显示出与已鉴定C肽密切相似的空间分布，同时揭示了内分泌限制性和内分泌-外分泌梯度在胰岛边界处的肽特异性差异。本研究建立了一个整合nano-DESI MSI、组织上MS/MS和分子网络的空间分辨肽发现框架，扩展了胰腺肽目录，并为未来研究肽加工在复杂胰腺组织中的作用奠定了基础。将该平台应用于疾病模型和定量流程，将支持对胰腺生理和病理中完整及截短肽的系统性研究。
