通过纳米通道富集技术及电位检测方法，可识别由纳米酶催化产生的氧化型显色底物，从而实现抗氧化剂的双重模式检测

《Microchemical Journal》：Nanochannel-enriched and potential-resolved detection of oxidized chromogenic substrate generated by nanozyme catalysis enables dual-mode sensing for antioxidant discrimination

　　

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  通过磁纳米酶催化生成ABTS^+•，再利用纳米通道进行富集以及电位分辨技术，从而构建出一种双模式颜色/电化学传感平台，用于区分不同抗氧化剂。
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  在电化学检测中，带负电荷的纳米通道可通过静电作用富集带正电荷的ABTS^+•，而在固定还原电位下进行计时安培法检测，则可实现ABTS^+•的电位分辨检测。
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  这种独特的双模式响应特性可用来区分四种不同的抗氧化剂，并对水果样本进行分类。

引言

抗氧化剂通过清除过量的活性氧物种，保护细胞免受氧化应激损伤，因此在维持细胞氧化还原平衡方面起着关键作用[1]。常见的膳食抗氧化剂包括抗坏血酸、半胱氨酸、柠檬酸和谷胱甘肽，这些都是源自食物来源的重要生物活性成分[2]、[3]。因此，食品中通常含有多种抗氧化剂，仅依靠某一种成分无法准确评估其抗氧化能力[4]、[5]。为全面评估食品质量，开发出能够检测并区分多种抗氧化剂的可靠分析方法具有重要意义。

由于成本低且能通过视觉信号读取结果，比色法被广泛用于检测抗氧化能力[6]、[7]、[8]。目前大多数比色法都依赖纳米酶来催化显色反应[8]、[9]。例如，具有过氧化物酶活性的Fe₃O₄基纳米酶可以催化H₂O₂分解产生活性氧，这些活性氧又会氧化显色底物，生成有色产物[10]、[11]、[12]。抗氧化剂则可以降低氧化后的显色产物浓度或清除活性氧，从而导致比色信号的强度随浓度变化而减弱。此外，与传统的化学氧化方法相比，基于磁性Fe₃O₄的纳米酶催化反应可以通过磁分离快速终止显色反应，从而实现对催化过程的精确时间控制，且不会引入额外的化学试剂或干扰反应环境[13]。不过，为了区分不同的抗氧化剂，大多数基于纳米酶的比色法都需要使用多种底物，如邻苯二胺、2,2′-偶氮双(3-乙基苯并噻唑-6-磺酸)和3,3′,5,5′-四甲基联苯胺[4]、[14]。这样的多底物系统会增加操作复杂性，需要多波长检测，且灵敏度往往较低。

另一种策略是开发基于单一显色底物的传感系统，该系统能够产生双模式信号输出[8]、[15]。例如，ABTS的氧化产物ABTS^+•不仅能产生在415纳米处有特征吸收峰的绿色物质，还具有可逆的氧化还原性质，因此可以同时实现颜色和电化学信号的检测[16]。与比色法相比，电化学检测具有灵敏度高、响应速度快以及易于微型化等优点[17]、[18]、[19]、[20]。尤其是计时安培法能够在固定还原电位下选择性地检测氧化中间体ABTS^+•[21]。尽管存在这种电位依赖性选择性，现有的ABTS^+•电化学检测方法大多采用均匀检测方式，所使用的电极缺乏针对ABTS^+•的特异性界面富集能力，因此限制了分析的灵敏度和准确性。此外，传统电极表面容易受到实际食品样品中杂质和大分子干扰物的污染，从而导致信号减弱且重复性差[22]、[23]、[24]。因此，开发出一种能够选择性富集ABTS^+•且具备抗污染能力的电化学界面，对于构建可靠的抗氧化剂分析双模式平台至关重要。

垂直有序介孔硅膜具有排列整齐的孔结构、较高的比表面积、出色的稳定性以及良好的生物相容性，因此为在比色系统中选择性富集ABTS^+•提供了理想载体[25]、[26]、[27]、[28]。VMSF表面丰富的硅烷醇基团（pK_a?=?2.0–3.0）在pH为4.0时容易失去质子，形成带负电荷的纳米通道，这些纳米通道可以通过静电作用选择性富集ABTS^+•，同时排除中性ABTS[29]、[30]、[31]、[32]。此外，VMSF极小的孔径（2–3纳米）可以通过尺寸排阻效应防止食品样品中的大分子污染物非特异性吸附[33]、[34]、[35]。因此，经过VMSF改性的电极有望通过实现选择性纳米通道富集和抗污染识别，从而克服传统ABTS^+•电化学检测方法的局限性，为抗氧化剂分析构建出稳定的双模式平台。

在此，我们通过将磁纳米酶催化与基于纳米通道的ABTS^+•富集及电位分辨电化学检测技术相结合，构建了一种双模式颜色/电化学传感平台（见图1）。具体而言，掺钴的Fe₃O₄纳米酶可以催化H₂O₂分解产生活性氧，这些活性氧进而氧化ABTS，生成在415纳米处有特征吸收峰的绿色ABTS^+•，从而实现颜色比色检测。在通过磁力去除Co-Fe₃O₄以终止催化反应后，可以利用经过VMSF改性的ITO电极通过计时安培法对生成的ABTS^+•进行电化学检测。带负电荷的VMSF纳米通道可以通过静电吸引选择性富集带正电荷的ABTS^+•，从而提高电极界面处电活性物质的浓度，增强还原电流。不同的抗氧化剂会不同程度地减弱ABTS^+•的浓度，进而产生不同的颜色和电化学响应特征。因此，这种双模式传感平台能够用于区分四种不同的抗氧化剂。本研究提出了一种新策略，将可控的纳米酶催化显色反应与VMSF辅助的纳米通道富集及电位分辨电化学检测技术相结合，为双模式抗氧化剂识别提供了有力工具。

章节摘要

试剂与仪器

所有试剂和仪器的详细信息均列于补充材料中。

共Fe₃O₄纳米酶的制备

共Fe₃O₄是通过一步溶剂热法合成的[36]。具体来说，先将0.5克FeCl₃·6H₂O和0.5克CoCl₂·6H₂O溶解在20毫升乙二醇中，在磁力搅拌下反应30分钟。随后，在持续搅拌的情况下依次加入3.0克醋酸钠和10毫升乙二胺。将得到的混合物转移到内衬特氟龙的不锈钢高压反应釜中

共Fe₃O₄纳米酶的特性分析

共Fe₃O₄纳米颗粒也是通过一步溶剂热法合成的，被用作类似过氧化物酶的纳米酶。乙二醇既作为溶剂又起到还原剂的作用，有助于在溶剂热条件下形成Fe₃O₄。同时，乙二胺可以与铁离子和钴离子结合，抑制其快速水解，从而实现金属离子的缓释。醋酸钠的水解会产生弱碱性环境，有利于铁和钴氧化物颗粒的成核与生长。钴离子则

结论

本研究构建了一种用于检测和区分抗氧化剂的颜色/电化学传感平台。该平台利用磁掺钴Fe₃O₄纳米酶催化ABTS氧化为绿色的自由基阳离子ABTS^+•，这一过程既能产生颜色信号，ABTS^+•本身也可作为电活性物质。为提升电化学检测的性能，该平台采用了经过VMSF改性的ITO电极，电极中的带负电荷纳米通道可以通过静电作用富集带正电荷的

CRediT作者贡献说明

李成伟：撰写原始稿件、方法部分、实验研究、数据整理。赵丽雅：撰写原始稿件、实验研究、数据整理。姜岩：负责方法设计、实验研究。赵静文：负责论文审阅与编辑、实验指导、方法设计、资金申请以及研究构思。

利益冲突声明

作者声明不存在任何可能影响本文研究结果的已知财务利益关系或个人关系。

致谢

我们感谢中国浙江省自然科学基金提供的资金支持（项目编号：LQN26B050004）。

李成伟|赵丽雅|姜岩|赵静文