《BioFactors》：Pulp Callus Extract From Malus domestica var. Mela Rosa Marchigiana Preserves Intestinal Barrier Integrity and Confers Neuroprotection in a Gut–Brain Axis Co-Culture Model
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肠-脑轴（gut–brain axis）是神经炎症性疾病（neuroinflammatory disorders）的关键靶点。研究人员调查了Mela Rosa Marchigiana果肉愈伤组织提取物（MRME）的保护作用，这是一种具有独特三萜类化合物（tri
肠-脑轴（gut–brain axis）是神经炎症性疾病（neuroinflammatory disorders）的关键靶点。研究人员调查了Mela Rosa Marchigiana果肉愈伤组织提取物（MRME）的保护作用，这是一种具有独特三萜类化合物（triterpenic）谱的植物复合物（phytocomplex）。利用一个经过验证的transwell肠-神经界面共培养模型，分化的Caco-2细胞形成极化的上皮屏障（顶端），而BV2小胶质细胞或SH-SY5Y神经元被接种在基底外侧室。顶端MRME预处理保护了Caco-2屏障完整性，抵抗脂多糖（LPS）或葡聚糖硫酸钠（DSS）诱导的损伤。MRME维持了occludin完整性和跨上皮电阻（TEER），有效中和了“肠漏”样条件。通过稳定屏障，MRME发挥了间接神经保护作用，因为高通量活细胞成像显示在BV2和SH-SY5Y细胞中，活性氧（ROS）生成和凋亡（caspase-3/7激活）均呈剂量依赖性减少。MRME表现出微生物学中性特征，在高达10,000?μg/mL浓度下对致病菌株或益生菌株均无抑制作用。MRME通过强化肠道屏障和屏蔽神经环境免受系统性炎症提供双重保护，这种作用是通过宿主细胞调节而非微生物干扰实现的。这些发现表明MRME是治疗肠-脑轴失调（gut–brain axis dysregulation）的有前景的营养保健品（nutraceutical）候选物。
**研究背景与问题**
肠-脑轴（gut–brain axis）是维持全身稳态和调节神经健康的关键双向通讯网络，其中肠道上皮屏障作为物理和功能界面，通过紧密连接蛋白（如occludin）维持完整性。屏障破坏（“肠漏”）可驱动系统性炎症和神经炎症过程，与阿尔茨海默病、帕金森病等神经退行性疾病相关。脂多糖（LPS）和葡聚糖硫酸钠（DSS）常被用于诱导肠道损伤模型，引发氧化应激和凋亡。天然生物活性化合物，特别是来自农业生物多样性的资源，受到广泛关注。Mela Rosa Marchigiana（MRM）是意大利马尔凯地区的古老苹果品种，其果肉愈伤组织提取物（MRME）富含五环三萜酸（pentacyclic triterpenic acids），具有抗氧化和抗炎活性。然而，MRME在肠-脑轴中的分子机制，尤其是通过屏障保护间接发挥神经保护作用的潜力，尚未被探索。因此，本研究旨在验证MRME是否通过维持肠道屏障完整性，间接保护神经细胞免受氧化应激和凋亡，并评估其对微生物群的安全性。该研究发表于《BioFactors》。
**主要技术方法**
研究人员采用已验证的transwell共培养模型模拟肠-脑通讯：将分化的Caco-2细胞（人类结肠癌细胞系）接种于插入物上形成极性上皮屏障（顶端侧），在基底外侧室培养BV2小胶质细胞（永生化小鼠小胶质细胞系）或SH-SY5Y神经元（人神经母细胞瘤细胞系）。关键方法包括：跨上皮电阻（TEER）测量以评估屏障完整性；免疫荧光染色检测occludin蛋白分布；活细胞成像系统（IncuCyte）结合CellROX试剂定量活性氧（ROS）生成，以及caspase-3/7绿色凋亡试剂检测凋亡激活；抗菌活性测定针对病原菌（Salmonella enteritidis ATCC 13076、Enterococcus faecalis ATCC 29212）和益生菌（Lactococcus lactis subsp. lactis NCTC 6681、Lactobacillus fermentum ATCC 9338、Lactobacillus delbrueckii subsp. bulgaricus NCTC 12712）。
**研究结果**
3.1 MRME Preserves Intestinal Epithelial Barrier Integrity（MRME保护肠道上皮屏障完整性）：通过免疫荧光和TEER测量，研究发现MRME（10 μg/mL）预处理显著抑制了LPS（0.1 μg/mL）或DSS（1%）诱导的occludin水平下降和TEER降低，维持了屏障完整性，且MRME本身不改变基础occludin水平。
3.2 MRME Attenuates Oxidative Stress in the Co-Cultured Neural Environment（MRME减轻共培养神经环境中的氧化应激）：活细胞成像显示，顶端MRME（1–100 μg/mL）预处理剂量依赖性地降低了LPS引发的基底外侧BV2和SH-SY5Y细胞中ROS水平，100 μg/mL时效果最显著。
3.3 MRME Mitigates DSS-Induced Oxidative Stress in the Co-Culture Model（MRME减轻共培养模型中DSS诱导的氧化应激）：类似地，MRME（1–100 μg/mL）预处理剂量依赖性地抑制了DSS引起的基底外侧神经细胞ROS升高，100 μg/mL时ROS接近基线水平。
3.4 MRME Mitigates LPS-Induced Apoptotic Cell Death in the Neural Compartment（MRME减轻LPS诱导的神经区域凋亡细胞死亡）：通过caspase-3/7荧光检测，MRME（1, 10, 100 μg/mL）剂量依赖性地减少了LPS诱导的BV2和SH-SY5Y细胞凋亡，100 μg/mL时效果最显著，且MRME单独处理无促凋亡作用。
3.5 MRME Mitigates DSS-Induced Apoptotic Cell Death in the Neural Compartment（MRME减轻DSS诱导的神经区域凋亡细胞死亡）：MRME预处理同样剂量依赖性地降低了DSS引起的caspase-3/7激活，100 μg/mL时显著保护神经细胞。
3.6 Effect of MRME on Pathogenic Bacterial Proliferation（MRME对致病菌增殖的影响）：MRME在1–10,000 μg/mL范围内对Salmonella enteritidis和Enterococcus faecalis均无杀菌活性，表明其保护作用不依赖直接抗菌机制。
3.7 Safety Profile of MRME on Probiotic Bacterial Strains（MRME对益生菌株的安全性）：MRME（1–10,000 μg/mL）对三种益生菌（Lactococcus lactis、Lactobacillus fermentum、Lactobacillus delbrueckii subsp. bulgaricus）的生长无抑制作用，细菌密度与对照组无差异，显示其生态中性。
**讨论与结论**
讨论部分指出，MRME通过稳定肠道屏障（类似于五环三萜酸如tormentic acid调节蛋白激酶途径和紧密连接蛋白）发挥多靶点作用。其顶端预处理显著降低了基底外侧的ROS和凋亡，表明屏障介导的信号转导机制（如抑制促炎细胞因子释放）是神经保护的关键。与纯化三萜化合物不同，MRME的植物复合物优势体现在对宿主细胞调节的优先性，避免了对微生物群的直接毒性，从而维持了微生物生态平衡。结论部分翻译如下：研究人员的研究结果提供了强有力的证据，表明MRME通过多层次机制作为肠-脑轴的全面调节剂。通过增强肠道屏障和维持紧密连接完整性，对抗系统性应激物的转位，MRME可能发挥调节ROS产生和神经细胞凋亡的作用，并可能减轻下游神经炎症和神经元损伤。值得注意的是，这些益处将在显著的“生态中性”下实现，因为MRME不干扰必需共生菌和精神益生菌（如Lactobacillus fermentum）的生长，可能确保功能性微生物生态位（用于神经活性代谢物生产）的维持。研究结果强调了MRME作为安全无创治疗候选物在肠-脑轴失调疾病中的潜力。鉴于其维持稳态而不引起菌群失调的能力，MRME可能代表一种新的辅助策略，用于预防或管理与“肠漏”和随之而来的慢性神经炎症相关的神经退行性疾病。未来的研究有必要在体内验证这些保护作用，并探索MRME独特三萜类成分（高浓度tormentic acid和annurcoic acid）的长期益处，其标准化植物化学指纹图谱为可重复的营养保健品开发提供了基础。
