整合多组学分析鉴定PDK4和ACOT1为糖尿病心肌病心肌纤维化相关的代谢枢纽基因

《Journal of Diabetes Research》：Integrated Multi-Omics Analysis Identifies PDK4 and ACOT1 as Metabolic Hub Genes Associated With Myocardial Fibrosis in Diabetic Cardiomyopathy

　　

糖尿病心肌病（Diabetic Cardiomyopathy, DCM）是糖尿病患者心力衰竭的关键病理驱动因素，主要以进行性心肌纤维化为特征。然而，连接上游代谢失调与下游心脏成纤维细胞异常激活的核心分子网络仍然大多未知。在本研究中，研究人员结合了体内和体外方法与生物信息学分析。研究人员建立了高脂饮食诱导的糖尿病心肌纤维化小鼠模型，并进行了转录组测序以筛选枢纽基因，随后在两个独立的DCM数据集中进行了验证。单细胞RNA测序揭示，在病理条件下，PDK4和ACOT1在心脏成纤维细胞中上调。体外实验证实，高糖诱导了人原代心脏成纤维细胞中PDK4、ACOT1和纤维化标志物的表达。分子对接预测了PDK4与ACOT1之间的潜在相互作用。总之，研究人员的发现将PDK4和ACOT1鉴定为与DCM心肌纤维化相关的进化保守的代谢枢纽基因，提示了一个假定的“代谢-纤维化轴”，并提供了潜在的治疗靶点。

**研究背景与问题**
糖尿病心肌病（Diabetic Cardiomyopathy, DCM）是糖尿病患者心力衰竭的主要病理驱动因素，其核心特征为进行性心肌纤维化。流行病学数据显示，糖尿病患者心力衰竭风险较非糖尿病患者高2至5倍，而DCM显著贡献于这一超额风险。尽管传统观点强调心肌细胞损伤在纤维化中的中心地位，但近年研究逐步揭示心脏成纤维细胞作为纤维化“执行者”的关键作用。然而，连接上游代谢紊乱（如高血糖、高脂血症、胰岛素抵抗）与下游心脏成纤维细胞异常激活的核心分子网络，特别是驱动纤维化进程的枢纽基因网络，仍尚未完全阐明。因此，本研究旨在通过整合动物模型、细胞实验及公共转录组数据，采用多组学分析策略系统性鉴定并验证在糖尿病心肌纤维化中发挥核心作用的枢纽基因，为理解其分子机制及开发靶向抗纤维化疗法提供理论基础。该研究发表于《Journal of Diabetes Research》。

**关键技术方法**
研究人员主要采用以下关键技术方法：1）建立高脂饮食（High-Fat Diet, HFD）诱导的C57BL/6J小鼠糖尿病心肌纤维化模型（样本来源：首都儿科研究所动物伦理委员会批准，购自江苏集萃药康生物科技股份有限公司）；2）对心肌组织进行转录组测序（RNA-seq，Illumina NovaSeq6000平台），通过差异表达分析、基因本体论（Gene Ontology, GO）和京都基因与基因组百科全书（Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes, KEGG）富集分析筛选差异表达基因（Differentially Expressed Genes, DEGs）；3）利用STRING数据库构建蛋白质-蛋白质相互作用（Protein-Protein Interaction, PPI）网络，并通过Cytoscape的cytoHubba插件（MCC算法）识别枢纽基因；4）在独立外部数据集（GSE5606、GSE210611）中进行验证，并通过书恩图确定共同DEGs；5）利用单细胞RNA测序数据集（GSE213337）分析枢纽基因在心脏成纤维细胞中的表达；6）体外实验：用人原代心脏成纤维细胞（ScienCell公司，美国）进行高糖（33 mM）刺激，通过实时定量聚合酶链反应（RT-qPCR）和Western blot检测基因及蛋白表达；7）分子对接（HDOCK服务器）预测PDK4与ACOT1的相互作用。

**研究结果**
**3.1 高脂饮食诱导的肥胖小鼠糖尿病心肌纤维化模型的建立与表征**
通过12周高脂饮食喂养C57BL/6小鼠，研究人员成功建立模型。与正常饮食组相比，高脂饮食组小鼠体重显著持续增加，口服葡萄糖耐量试验（OGTT）显示空腹及120分钟血糖水平显著升高，马松三色染色证实左心室心肌纤维化面积显著增加，表明模型成功复制了糖尿病心肌纤维化表型。

**3.2 转录组分析揭示肥胖糖尿病小鼠心肌中的差异基因表达谱**
对心肌组织进行RNA-seq，差异表达分析（|log₂FC|≥1，p<0.05）揭示高脂饮食组小鼠心脏具有独特的转录组特征。GO富集分析显示DEGs在脂质代谢相关生物学过程、神经元相关细胞组分（如突触后膜）及神经递质受体活性等分子功能中显著富集。KEGG通路富集分析表明这些基因显著聚类于“缬氨酸、亮氨酸和异亮氨酸降解”、“谷氨酸能突触”及“吗啡成瘾”等通路。PPI网络分析及cytoHubba鉴定出前5个枢纽基因：Pdk4、Hmgcs2、Acot1、Nr1d1和Cyp1a1。

**3.3 在外部DCM数据集中鉴定和验证枢纽基因**
在两个独立DCM数据集（GSE5606和GSE210611）中，通过差异表达分析鉴定出12个共同DEGs。GO分析显示这些基因富集于“乙酰辅酶A代谢过程”、“线粒体内膜”和“酰基辅酶A水解酶活性”等条目。KEGG分析显示富集于“不饱和脂肪酸生物合成”、“丁酸代谢”、“胆固醇代谢”及“PPAR信号通路”。PPI网络及cytoHubba鉴定出前5个枢纽基因：Pdk4、Angptl4、Hmgcs2、Cyp1a1和Acot1，其中4个（Pdk4、Hmgcs2、Acot1、Cyp1a1）与小鼠模型结果重叠，表明跨模型和物种的高度一致性。

**3.4 枢纽基因在DCM进展过程中的时间表达模式**
利用GSE4745数据集分析五个枢纽基因在糖尿病诱导后第3、28、42天的表达动态。聚类热图及时间表达曲线显示，与对照组相比，Pdk4、Acot1和Hmgcs2在所有时间点均呈现一致且显著的持续上调，而Nr1d1和Cyp1a1的表达模式较为多变，未呈现明确规律性变化。

**3.5 糖尿病心肌纤维化过程中枢纽基因在心脏成纤维细胞中的表达**
对单细胞RNA测序数据集GSE213337进行分析，细胞组成分析显示心脏成纤维细胞在两组中均占显著比例。UMAP可视化揭示疾病组与对照组整体转录组景观差异，以及心脏成纤维细胞的特异性分布。在成纤维细胞群体中，气泡图显示疾病状态下五个枢纽基因的平均表达水平和表达细胞百分比均高于对照组；火山图进一步确认多个枢纽基因在糖尿病心肌纤维化心脏成纤维细胞中显著上调，为枢纽基因在驱动纤维化过程中的功能提供了直接的单细胞水平证据。

**3.6 人原代心脏成纤维细胞的体外功能验证**
在体外模型中，用高糖（33 mM）刺激人原代心脏成纤维细胞5天。RT-qPCR结果显示，高糖显著诱导了枢纽基因PDK4、ACOT1、NR1D1、CYP1A1以及经典纤维化标志物TGF-β1的mRNA表达（等渗对照未引起类似变化），而HMGCS2和COL3A1的mRNA虽未达统计学显著，但呈上升趋势。分子对接模拟提示PDK4与ACOT1之间存在潜在蛋白-蛋白相互作用界面。Western blot证实，与正常糖浓度相比，高糖环境下PDK4、ACOT1、TGF-β1、Vimentin及Collagen III的蛋白表达水平均显著升高，确认高糖可特异性激活PDK4和ACOT1等枢纽基因及纤维化通路。

**讨论与结论**
讨论部分强调，本研究通过多组学分析揭示了PDK4和ACOT1作为核心枢纽基因在糖尿病心肌纤维化中的作用。HFD模型成功模拟了2型糖尿病特征，转录组分析表明代谢紊乱和神经信号通路重编程是纤维化的前驱事件。外部数据集验证显示PDK4和ACOT1跨物种保守，且功能富集于PPAR信号通路和乙酰辅酶A代谢，提示代谢调节网络的核心地位。单细胞分析将PDK4和ACOT1的表达定位于心脏成纤维细胞，拓展了代谢枢纽基因的功能语境，提出“代谢信号直接指导纤维化程序”的新视角。体外实验证实高糖通过激活PDK4和ACOT1驱动成纤维细胞向促纤维化表型转化，分子对接预测了两者的潜在相互作用。研究提出“代谢-纤维化轴”假说：糖尿病代谢紊乱激活PPAR通路，诱导PDK4/ACOT1表达，驱动心脏成纤维细胞代谢重编程，增强其对TGF-β信号的响应，导致细胞外基质沉积。同时，研究指出局限性：样本量较小、未进行因果性功能实验、缺乏细胞类型特异性验证、以及分子对接需进一步实验确认。结论部分翻译如下：多组学研究表明，PDK4和ACOT1是与DCM心肌纤维化相关的进化保守的代谢枢纽基因。跨物种生物信息学验证和单细胞转录组分析揭示其在糖尿病应激下心脏成纤维细胞中特异性上调。体外功能验证确认高糖选择性诱导人心脏成纤维细胞中PDK4、ACOT1及关键纤维化标志物的表达。分子对接计算预测这两种蛋白之间存在潜在相互作用，有待未来实验验证。研究人员的发现支持一个假设性的“代谢-纤维化轴”范式，其中代谢应激激活心脏成纤维细胞内的PDK4/ACOT1模块，将全身性糖尿病扰动转化为促纤维化转录程序。该假说虽得到多个独立数据集和体外模型的相关性证据支持，但需通过因果性功能获得和缺失实验进行决定性检验。本研究将DCM代谢失调的焦点转向成纤维细胞组分，揭示PDK4和ACOT1作为精准抗纤维化干预的有前景的治疗靶点。