细胞状态分辨的转录组分析揭示年龄相关性黄斑变性中以巨噬细胞为中心的焦亡相关炎症程序

《SLAS Technology》：Cell-state-resolved transcriptomic analysis reveals macrophage-centered pyroptosis-related inflammatory programs in age-related macular degeneration

　　

背景：年龄相关性黄斑变性（AMD）伴随视网膜色素上皮（RPE）/脉络膜复合体的炎症变化，但焦亡（pyroptosis）相关转录程序在人类AMD组织中的细胞来源仍不清楚。本研究以单细胞分辨率（single-cell resolution）分析了这些程序，并探索了候选调控分子。

方法：研究人员分析了人类RPE/脉络膜单细胞RNA测序（scRNA-seq）数据集GSE135922，以定义细胞簇、焦亡相关基因（pyroptosis-related genes）和调节子（regulons）。应用AUCell（Area Under the Curve-based Cell scoring）评估单个细胞类型中焦亡相关特征活性（pyroptosis-related signature activity）。通过通路富集（pathway enrichment）、亚聚类（subclustering）和Monocle 2伪时间分析（pseudo-time analysis）检查得分最高的巨噬细胞簇，并基于SCENIC（Single-cell regulatory network inference and clustering）的调节子分析推断候选转录调控因子（transcriptional regulators）。还在T细胞、内皮细胞和成纤维细胞亚簇中评估了焦亡相关基因和转录因子。在激光诱导的脉络膜新生血管（CNV）小鼠模型中进行批量RNA测序（bulk RNA sequencing）和免疫荧光（immunofluorescence）作为支持证据。

结果：在人类RPE/脉络膜细胞簇中，检测到60个簇特异性焦亡相关标记基因（marker genes）。在细胞类型排序中，巨噬细胞、T细胞、内皮细胞和成纤维细胞在各簇中显示出相对较高的焦亡相关特征活性，其中Macrophages-2信号最高，RPE细胞活性较低。Macrophages-2的标记基因富集于免疫和炎症通路，包括补体和凝血级联（complement and coagulation cascades）、NOD样受体信号（NOD-like receptor signaling）和NF-κB信号（NF-κB signaling）。伪时间分析将Macrophages-2解析为不同的轨迹，NLRP3富集于一个分支后状态，与巨噬细胞状态异质性（macrophage state heterogeneity）而非均匀激活一致。IRF1、STAT3和NEAT1在细胞类型特异性分析中重复出现，且Irf1/Stat3蛋白信号在CNV病变中更高。

结论：这些发现表明AMD中存在以巨噬细胞为中心、细胞状态特异性的焦亡相关炎症重塑模式。分支相关的NLRP3炎症小体（NLRP3 inflammasome）特征，连同IRF1、STAT3和NEAT1，定义了值得进一步机制评估的候选分子特征。

**论文解读：细胞状态分辨的转录组分析揭示年龄相关性黄斑变性中以巨噬细胞为中心的焦亡相关炎症程序**

**研究背景与问题**

年龄相关性黄斑变性（AMD）是发达国家老年人不可逆失明的主要原因，其病理特征包括视网膜色素上皮（RPE）和脉络膜内皮细胞的变性。晚期AMD分为非新生血管性（干性）和新生血管性（湿性），后者由脉络膜新生血管（CNV）引起，导致出血和中心视力丧失。尽管既往研究提示凋亡并非唯一机制，但焦亡（pyroptosis）——一种炎症性程序性细胞死亡——在AMD中的细胞来源和转录组织仍不清楚。单细胞RNA测序（scRNA-seq）能够解析细胞异质性，但焦亡相关转录程序在RPE/脉络膜微环境中的分布（是否集中于免疫、血管或基质细胞状态）尚未明确。因此，本研究旨在通过单细胞分辨率分析人类AMD组织中焦亡相关转录程序，并探索候选调控分子。

**研究概述与意义**

研究人员分析了公开的scRNA-seq数据集GSE135922（包含7个供体的RPE/脉络膜样本，其中2例AMD、5例对照），利用AUCell评分、亚聚类、伪时间轨迹分析和SCENIC调节子推断，系统绘制了焦亡相关转录图谱。在激光诱导CNV小鼠模型中通过批量RNA测序和免疫荧光进行验证。研究发现焦亡相关特征活性主要集中于炎症性巨噬细胞亚群（Macrophages-2），而非RPE细胞，且该亚群内存在分支依赖的NLRP3炎症小体富集程序。此外，T细胞、内皮细胞和成纤维细胞中也存在细胞类型特异性焦亡相关模块，其中STAT3和IRF1调节子活性反复出现，NEAT1表达跨多种细胞类型。该研究首次以细胞状态分辨率揭示了AMD中巨噬细胞为中心的焦亡相关炎症重塑模式，为理解AMD的免疫机制提供了候选分子靶点。论文发表在《SLAS Technology》。

**主要技术方法（不超过250字）**

本研究以GSE135922数据集（7个供体，2例AMD、5例对照，含CD31磁珠富集步骤）为人类样本来源。关键技术方法包括：1）AUCell评分，用于量化单个细胞中焦亡相关基因集（从GeneCards数据库获取403个基因）的特征活性；2）Seurat亚聚类，对高评分巨噬细胞簇进行再分群；3）Monocle 2伪时间分析，构建细胞发育轨迹并识别分支依赖基因；4）SCENIC调节子分析，推断转录因子（TF）调控网络并筛选焦亡相关TF；5）批量RNA测序与免疫荧光，在激光诱导CNV小鼠模型（C57BL/6J雄性小鼠，术后7天）中验证候选分子的表达和蛋白定位。

**研究结果**

**3.1 人类RPE/脉络膜单细胞图谱和细胞类型鉴定**
通过无监督聚类分析GSE135922中的18,569个细胞，鉴定出15个细胞簇，利用已知标记基因（如PLP1、VWF、RPE65等）标注为Schwann细胞、黑色素细胞、内皮细胞、周细胞、成纤维细胞、RPE、B细胞、T细胞、巨噬细胞、肥大细胞和残余光感受器细胞。AMD与正常样本的聚类结构相似，但细胞比例存在描述性差异（AMD中B细胞和巨噬细胞比例降低，T细胞比例升高）。

**3.2 焦亡相关基因的簇特异性表达谱**
将各簇差异表达基因（DEGs）与403个焦亡相关基因取交集，获得60个簇特异性标记基因。其中，Macrophages-2富集了包括IL1B、NLRP3、PYCARD、IL18、TNF等在内的炎症小体/细胞因子共表达模块，而RPE细胞只贡献了1个标记基因（BSG），表明焦亡相关转录信号并非均匀分布。

**3.3 巨噬细胞为中心的焦亡相关特征活性与炎症程序**
AUCell评分显示Macrophages-2具有最高的焦亡相关特征活性，远高于另一个巨噬细胞亚群（Macrophages-1）。KEGG和GO富集分析表明Macrophages-2的标记基因显著富集于补体与凝血级联、NOD样受体信号、NF-κB信号、细胞因子产生和白细胞趋化等免疫炎症通路。GSEA和GSVA进一步确认了其广泛的炎症通路激活，而RPE细胞活性较低。AMD与对照的供体水平比较未达到统计学显著，但提供了描述性支持。

**3.4 Macrophages-2亚簇内的焦亡相关转录异质性与CNV模型支持证据**
对Macrophages-2进行亚聚类得到4个亚簇，鉴定出12个焦亡相关DEGs（如SERPINB1、TNF、NEAT1等），分别富集于亚簇1-3。在激光诱导CNV小鼠的批量RNA测序中，Il1rn、Tnf、Jun、Kcnq1ot1和Neat1显著上调，验证了部分人类转录特征。

**3.5 伪时间分析揭示分支巨噬细胞状态转换及不同焦亡相关程序**
Monocle 2伪时间轨迹显示Macrophages-2呈分支结构，两个分支后轨迹分别由亚簇1和亚簇2主导。分支表达分析建模（BEAM）识别出69个分支依赖的焦亡相关基因，其中NLRP3、YWHAZ、VPS4B沿细胞命运2富集，而STK4、MALT1、HMGB1沿细胞命运1富集，表明巨噬细胞状态异质性驱动NLRP3相关炎症小体程序的差异。

**3.6 T细胞亚簇显示异质性焦亡相关基因表达及STAT3/ETS1调节子活性**
T细胞亚聚类（5个亚簇）中，亚簇2、4、5分别表达PRF1/GZMB、MALAT1/NEAT1/STK4、HSP90AA1/HSP90AB1等焦亡相关基因。SCENIC分析显示亚簇4中STAT3和ETS1调节子活性最高，提示特定T细胞亚群可能参与焦亡相关调控。

**3.7 内皮细胞亚簇2共富集焦亡相关炎症基因与STAT3/IRF1调节子活性**
内皮细胞亚聚类（3个亚簇）中，亚簇2高表达ICAM1、BIRC3、VCAM1，且STAT3和IRF1调节子活性最高，而其他亚簇活性较低，表明内皮细胞存在状态依赖的焦亡相关转录特征。

**3.8 成纤维细胞亚簇6共富集多个焦亡相关转录本与STAT3/IRF1调节子活性**
成纤维细胞亚聚类（6个亚簇）中，亚簇6表达最多焦亡相关DEGs（包括NEAT1、IRF1、STAT3、MALAT1、XIST），且STAT3和IRF1调节子活性显著高于其他亚簇。CNV小鼠模型中Chi3l1、Neat1、Stat3表达上调，进一步支持该亚簇的炎症倾向。

**3.9 激光诱导CNV小鼠中Irf1和Stat3蛋白信号的免疫荧光评估**
在CNV病变区域，Irf1和Stat3蛋白信号与异凝集素B4（IB4）阳性新生血管结构部分重叠，提供了蛋白水平的空间支持，与单细胞转录和调节子结果一致。

**讨论与结论总结**

讨论部分指出，焦亡相关特征活性并非均匀分布于RPE/脉络膜微环境，而是集中于炎症性巨噬细胞亚群（Macrophages-2），其携带了NLRP3、PYCARD、IL1B、IL18等组成的炎症小体/细胞因子模块，且伪时间分析揭示了分支依赖的NLRP3富集状态。T细胞、内皮细胞和成纤维细胞亚群也呈现细胞类型特异性焦亡相关模块，其中STAT3和IRF1调节子活性反复出现，NEAT1在多个细胞类型中表达，并且在CNV小鼠模型中证实了Irf1/Stat3蛋白信号。这些结果支持AMD中以巨噬细胞为中心、细胞状态特异性的焦亡相关炎症重塑模式。研究结论翻译如下：**这些发现表明AMD中存在以巨噬细胞为中心、细胞状态特异性的焦亡相关炎症重塑模式。分支相关的NLRP3炎症小体特征，连同IRF1、STAT3和NEAT1，定义了值得进一步机制评估的候选分子特征。**