人抗体靶向副流感病毒血凝素-神经氨酸酶蛋白的保护和交叉保护的分子基础

《Journal of Virology》：Molecular basis for protection and cross-protection by human antibodies targeting the parainfluenza virus hemagglutinin-neuraminidase protein

　　

摘要：人副流感病毒（human parainfluenza viruses，PIVs）是呼吸道疾病的主要原因，尤其在易感人群中，感染可导致严重疾病。尽管临床影响重大，但目前尚无许可的疫苗或有效的抗病毒治疗。PIVs有两种大的表面蛋白，融合蛋白（F）和血凝素-神经氨酸酶（hemagglutinin-neuraminidase，HN）蛋白，两者均为中和抗体的靶标。在本研究中，研究人员鉴定并表征了两种人单克隆抗体（monoclonal antibodies，mAbs），5217-2和5217-9，它们结合重组PIV3 HN蛋白，识别PIV3感染的细胞，并在体外中和病毒。研究人员通过生物层干涉测量法（biolayer interferometry）确定了PIV3 HN特异性mAbs的抗原位点，发现mAb 5217-9靶向一个先前定义的中和抗原位点，而mAb 5217-2结合一个不同的抗原位点，扩展了已知的抗原景观。为了进一步理解新定义的表位，研究人员确定了mAb 5217-2与PIV3 HN复合物的冷冻电镜（cryo-electron microscopy，cryo-EM）结构，揭示了一个邻近PIV3 HN蛋白受体结合位点的表位。研究人员还确定了先前发现的抗PIV3 HN mAb PIV3HN-09的结构，该抗体先前已被证明在体内具有部分保护作用。在PIV3的仓鼠攻毒模型中，mAb 5217-2显著降低了肺部病毒滴度，证明了其保护能力。此外，由于mAb PIV3HN-05先前被证明能交叉中和PIV1，研究人员在PIV1攻毒模型中评估了其保护效力，显示其降低了肺部病毒滴度。总体而言，这些发现为PIV3 HN表位提供了新见解，以支持基于结构的疫苗设计，并展示了针对PIV3和PIV1的保护性mAbs。重要性：人副流感病毒（PIVs）是呼吸道疾病的主要原因，但目前尚无许可的疫苗或靶向抗病毒疗法。更好地理解抗体如何识别病毒表面蛋白对于开发有效干预措施至关重要。在本研究中，研究人员鉴定了中和PIV3的人单克隆抗体，并定位了它们识别的病毒血凝素-神经氨酸酶（HN）蛋白的特定区域。结构分析揭示了HN活性位点附近一个先前未表征的抗体结合位点，并扩展了该蛋白已知的抗原景观。研究人员还在动物模型中展示了这些抗体对PIV3和PIV1感染的保护活性。这些发现提供了新靶点和结构见解，可指导针对PIVs的疫苗和抗体疗法的开发。

**论文解读：人副流感病毒血凝素-神经氨酸酶蛋白靶向抗体的保护与交叉保护分子基础**

**研究背景与问题**

人副流感病毒（human parainfluenza viruses，PIVs）是导致儿童、免疫缺陷人群及老年人急性呼吸道感染（acute respiratory infection，ARI）的主要病原体，可引发哮吼、支气管炎、肺炎等严重疾病，尤其在5岁以下儿童中具有最高的住院率。尽管临床负担沉重，但目前尚无针对PIVs的许可疫苗或有效抗病毒疗法。PIVs属于副黏病毒科（Paramyxoviridae），其表面存在两种关键糖蛋白：融合蛋白（F）和血凝素-神经氨酸酶（hemagglutinin-neuraminidase，HN）。HN蛋白具有双重功能：通过血凝素活性结合宿主细胞表面的唾液酸受体，以及通过神经氨酸酶活性在病毒出芽时切割唾液酸释放病毒颗粒。此外，HN蛋白还负责激活F蛋白，从而介导病毒包膜与宿主细胞膜的融合。这两种蛋白均为中和抗体的主要靶点，但现有研究对PIV3 HN蛋白上的抗原表位认识尚不完整，尤其缺乏对交叉保护性抗体作用机制的结构解析。因此，开发针对PIVs的预防和治疗策略，特别是通过单克隆抗体（monoclonal antibodies，mAbs）进行被动免疫，具有迫切需求。本研究旨在鉴定靶向PIV3 HN蛋白的新型人mAbs，阐明其表位特征、中和机制及体内保护效力，为基于结构的疫苗设计和抗体疗法提供依据。

**研究内容与结论**

研究人员从健康人外周血单个核细胞（peripheral blood mononuclear cells，PBMCs）中分离出靶向PIV3 HN的B细胞，通过单细胞RNA测序和二代测序获得配对抗体重链和轻链序列，重组表达并鉴定出两种人mAbs——5217-2和5217-9。这两种mAbs均能结合重组PIV3 HN蛋白，识别感染细胞，并在体外中和病毒。通过生物层干涉测量法（biolayer interferometry，BLI）进行表位分型，发现mAb 5217-9与先前定义的抗原位点1（antigenic site 1）的mAbs竞争结合，而mAb 5217-2则结合一个全新的抗原位点，命名为抗原位点4（antigenic site 4），扩展了PIV3 HN蛋白的抗原图谱。利用冷冻电镜（cryo-electron microscopy，cryo-EM）解析了mAb 5217-2与PIV3 HN的复合物结构，显示其表位位于HN头部结构域顶端，邻近受体结合位点，但未直接重叠。同时，研究人员解析了先前发现的抗PIV3 HN mAb PIV3HN-09（靶向抗原位点3）的cryo-EM结构，显示其结合于HN二聚体界面一侧，远离抗原位点1。进一步地，通过重新处理cryo-EM数据，获得了更高分辨率的抗原位点2 mAb PIV3HN-05与PIV3 HN的复合物结构，显示其HCDR3环直接插入HN的唾液酸结合口袋，解释了其强效中和活性及对PIV1的交叉中和能力。在体内实验中，预防性给予mAb 5217-2（10 mg/kg）可显著降低叙利亚金仓鼠PIV3攻毒后的肺部病毒滴度（约4.5倍减少）。此外，mAb PIV3HN-05在PIV1攻毒模型中完全抑制了肺部病毒复制（检测限以下），证明了其交叉保护效力。这些发现揭示了PIV3 HN蛋白上多个抗原位点的结构和功能差异，为开发针对PIV3和PIV1的通用疫苗和抗体疗法提供了新靶点。

**关键技术与方法**

1. **B细胞分选与单克隆抗体发现**：从Shepeard Blood Bank（Augusta, GA）获得的健康人白细胞滤器中分离PBMCs，利用流式细胞术分选PIV3 HN蛋白特异性B细胞，通过10× Genomics单细胞RNA测序和二代测序获得配对抗体可变区序列，克隆至表达载体后重组表达mAbs。
2. **体外结合与中和活性测定**：采用酶联免疫吸附测定（ELISA）评估mAbs与重组PIV3 HN蛋白的结合能力；通过流式细胞术检测mAbs与PIV3感染细胞的结合；利用噬斑减少中和试验（plaque reduction neutralization assay）测定mAbs对PIV3的半数抑制浓度（IC₅₀）。
3. **表位分型与结构解析**：采用生物层干涉测量法（BLI）进行竞争性表位分型，通过配对组合实验确定mAbs间的竞争关系；利用冷冻电镜（cryo-EM）解析mAb-Fab与PIV3 HN蛋白复合物的高分辨率结构，并通过AlphaFold3预测模型进行拟合和手动修正。
4. **体内保护效力评估**：采用叙利亚金仓鼠（Syrian golden hamsters）模型，通过腹腔注射预防性给予mAbs（10 mg/kg），24小时后经鼻内攻毒PIV3或PIV1，4天后取肺组织匀浆，通过噬斑试验测定病毒滴度。

**研究结果**

**1. 靶向PIV3 HN的mAbs的结合与中和特性**
通过ELISA和流式细胞术证实，mAbs 5217-2和5217-9均能特异性结合重组PIV3 HN蛋白及PIV3感染的LLC-MK2细胞（EC₅₀分别为9 ng/mL和17 ng/mL）。噬斑减少中和试验显示，5217-2对PIV3的中和活性IC₅₀为3 ng/mL，强于对照抗F mAb PIA174（IC₅₀为15 ng/mL）；5217-9的IC₅₀为70 ng/mL。

**2. PIV3 HN靶向mAbs介导的补体沉积**
通过补体C3沉积试验评估Fc效应功能。5217-2诱导的C3沉积信号较无mAb对照增强150倍，超过先前最强的PIV3HN-03（47倍）；5217-9仅增强40倍。阴性对照抗肺炎球菌mAb PhtD7无效应。这表明补体沉积能力与中和活性无直接相关性。

**3. 表位定位揭示PIV3 HN蛋白上的新抗原位点**
利用BLI进行竞争性表位分型（包含6个已知mAbs和2个新mAbs），结果显示5217-2与所有已知抗原位点1-3的mAbs均无竞争，形成独特的结合模式，因此定义为一个新抗原位点——抗原位点4。而5217-9与抗原位点1的mAbs（如PIV3HN-13）竞争，归属于抗原位点1。

**4. 抗原位点3 mAb PIV3HN-09结合于抗原位点1 mAb PIV3HN-13的对侧**
通过cryo-EM解析PIV3HN-09 Fab与PIV3 HN（同时结合PIV3HN-13 Fab）的复合物结构，分辨率2.95 ?。结构显示PIV3HN-09结合于HN二聚体界面附近，远离PIV3HN-13的结合位点。其表位主要由重链互补决定区（HCDR）1、2、3的残基通过氢键与HN的His342、Pro343、Ser282、Ser283、Glu341等残基相互作用，轻链无显著接触。

**5. 抗原位点4 mAb 5217-2结合于F-HN结合界面的对侧**
通过cryo-EM解析5217-2 Fab与PIV3 HN（结合PIV3HN-09 Fab）的复合物结构，分辨率3.29 ?。结构显示5217-2结合于HN头部结构域顶端，远离F-HN结合界面。其表位主要由重链HCDR3残基Asp108与Arg173、Lys171形成氢键，以及框架区残基Asp66（HFR3）和Asn66（LFR3）分别与Lys168和Arg522相互作用，依赖单一CDR环。

**6. 抗原位点2 mAb PIV3HN-05交叉保护PIV1和PIV3的分子基础**
通过重新处理cryo-EM数据，获得PIV3HN-05 Fab与PIV3 HN（结合PIV3HN-13 Fab）的更高分辨率结构（3.29 ?）。结构显示PIV3HN-05的HCDR3环深插入HN的唾液酸结合口袋，通过5个氢键（与Glu462、Asn461、Thr475、Cys214、Arg424）直接占据活性位点，从而阻断受体结合。将HCDR3环叠加至PIV1 HN结构模型上，显示其同样能插入PIV1的唾液酸结合口袋，且关键接触残基在PIV1和PIV3间高度保守（序列比对显示完全保守或相似替换），解释了交叉中和的分子基础。在体内，PIV3HN-05（10 mg/kg）预防性给药完全抑制了PIV1攻毒后仓鼠肺部的病毒复制（检测限以下），而PBS对照组平均病毒滴度为6.8×10³ ffu/肺。

**7. 抗原位点1-4 mAbs与PIV3 HN头部的结合模型**
将四种抗原位点特异性Fabs（位点1：PIV3HN-13；位点2：PIV3HN-05；位点3：PIV3HN-09；位点4：5217-2）拟合至PIV3 F-HN复合物的冷冻电镜断层扫描（cryo-ET）密度图（EMD-27550）中，显示位点3 mAb结合于HN-F相互作用界面附近，与先前报道的融合抑制活性一致；位点4 mAb结合于唾液酸结合口袋外侧，邻近受体结合区域，可能通过空间位阻或限制构象灵活性发挥中和作用。序列分析显示，这些mAbs的表位残基在临床分离株中高度保守，支持其潜在临床广度。

**8. 抗原位点4 mAb 5217-2阻止病毒在叙利亚金仓鼠肺中的复制**
在PIV3攻毒模型中，5217-2（10 mg/kg）预防性给药后，仓鼠肺部病毒滴度平均为4.7×10³ ffu/肺，较PBS对照组（2.2×10⁴ ffu/肺）显著降低（约4.5倍，P=0.0032），证实其体内保护效力。

**讨论与结论**

讨论部分指出，PIV3 HN蛋白的抗原位点2仍是强效中和抗体的主要靶点，但新发现的抗原位点4 mAb 5217-2表现出更强的补体沉积活性，提示表位依赖性结构特征可独立于中和作用影响Fc效应功能。结构分析表明，抗原位点3 mAb PIV3HN-09结合于HN-F界面，可能通过空间位阻干扰F蛋白激活；抗原位点2 mAb PIV3HN-05直接占据唾液酸结合口袋，是交叉中和PIV1的关键；抗原位点4 mAb 5217-2结合于头部顶端，可能通过阻碍受体进入或限制构象灵活性发挥保护作用。研究局限性包括：仅评估预防性给药，未测试治疗性；未评估临床疾病体征或组织病理；仓鼠模型与人类的补体调节差异可能影响Fc效应功能翻译；仅测试补体依赖性细胞毒性，未评估其他Fc介导机制（如抗体依赖性细胞吞噬或自然杀伤细胞介导的细胞毒性）。未来研究需纳入治疗性模型和更全面的Fc效应功能评估。

**研究结论**：研究人员的研究加深了对PIV3 HN蛋白抗原景观的理解，突出了不同表位在介导抗体保护中的独特作用。识别PIV3 HN上多个具有不同中和和补体诱导特性的抗原位点，为合理疫苗设计策略提供了框架，这些策略旨在诱导靶向保守和关键区域（如抗原位点2）的抗体。通过整合表位分型、噬斑减少中和试验、结构表征和体内效力研究，研究人员得出结论，靶向抗原位点2和4的单克隆抗体（mAbs）是最有希望进一步研究的靶点。研究结果强调了靶向抗原位点2的抗体的强大保护能力，特别是mAb PIV3HN-05，它结合PIV3 HN蛋白上一个关键且保守的区域。为了进一步理解其交叉保护活性的基础，未来研究应探究mAb PIV3HN-05与PIV1 HN蛋白的结构相互作用。此外，应进一步评估其他抗原位点2 mAbs（如PIV3HN-11）的体内效力和结构相互作用，该mAb已被证明能抑制PIV3与宿主细胞的融合。这些努力将有助于指导开发靶向PIV3 HN蛋白以及其他副流感病毒HN蛋白的广泛保护性单克隆抗体。