非复制型痘苗病毒天坛株经基因组改造后复制与免疫原性增强，在小鼠中实现低剂量强效保护

《Journal of Virology》：Enhanced replication and immunogenicity of a genome-modified non-replicating vaccinia virus Tiantan strain for robust low-dose protection in mice

　　

一种基于非复制型天坛株的痘苗病毒（non-replicating Tiantan strain-based vaccinia virus, NTV）在疫苗接种与基因治疗中具有重要应用前景，并作为抗猴痘（mpox）的新型安全候选疫苗进入临床试验。然而其在生产工艺产能与免疫原性方面仍需优化。研究人员利用CRISPR/Cas9介导的基因编辑与同源重组，在非复制型病毒骨架中改造F1L与C7L基因，构建重组病毒NTV-ΔF1L-C7L。该构型在疫苗生产细胞系中复制显著增强，于MRC-5细胞中病毒产量较亲本NTV提高逾680倍；小鼠体内致病力较痘苗病毒天坛株（vaccinia virus Tiantan strain, VTT）降低逾10倍。经两次肌内注射后，NTV-ΔF1L-C7L诱导出高效价正痘病毒属（Orthopoxvirus）特异性IgG及抗痘苗与抗猴痘中和抗体，并激发偏Th1型的强烈细胞免疫，显著强于亲本NTV或VTT。以低剂量（103 PFU）或单次剂量（105 PFU）免疫小鼠，对致死量痘苗病毒Western Reserve株攻击均实现100%完全保护，效力与VTT相当。结果表明NTV-ΔF1L-C7L兼具高安全性、复制增强与免疫原性提升，可作为新型疫苗载体并有望用于全球猴痘防控。

研究背景与立项依据

痘苗病毒（vaccinia virus, VACV）属正痘病毒属，曾用于全球根除天花，后因广谱宿主嗜性、高外源基因表达效率与强免疫原性，被广泛开发为疫苗载体与溶瘤病毒平台。但传统VACV疫苗（如ACAM2000）不良反应明显，改良安卡拉株（modified vaccinia virus Ankara, MVA）等减毒株虽安全性提升，却存在生产受限或免疫原性偏弱等问题。2022年全球猴痘疫情后，现有WHO批准疫苗（ACAM2000、JYNNEOS、LC16m8）均源于减毒VACV，但分别受限于不良反应、产能不足与需划痕接种。中国天坛株（VTT）曾广泛用于天花免疫，研究人员前期删除26个宿主范围与毒力基因构建了非复制型NTV，已获中国临床试验许可用于猴痘候选疫苗；但NTV在连续细胞系中产量低、晚期蛋白表达受损、等效剂量下免疫原性弱于MVA。因此需在保持安全性的前提下，恢复其复制与抗原表达能力并进一步增强免疫激活。

研究人员以NTV为骨架，删除抗凋亡基因F1L（编码定位于线粒体外膜的尾锚定蛋白，稳定膜电位抑制凋亡）并回补宿主范围因子C7L（拮抗SAMD9限制因子、调控晚期基因表达），经CRISPR/Cas9与同源重组获得NTV-ΔF1L-C7L，系统评估其体外复制、体内安全、体液与细胞免疫及攻毒保护。

主要关键技术方法

研究使用鸡胚成纤维细胞（CEF）、人MRC-5、非洲绿猴Vero、小鼠BALB/c 3T3及人HeLa等多物种细胞系，以及6至8周龄雌性BALB/c小鼠队列（含肌注免疫、鼻内攻毒与尾划痕毒力模型）。核心技术包括：CRISPR/Cas9介导定点编辑结合同源重组构建重组病毒；以MPXV（clade IIb）特异性抗体行Western blot检测早/晚期蛋白与凋亡标志（PARP、caspase-3/8/9）；多步与单步生长曲线及免疫组化斑片扩散评估复制；小鼠双剂肌注或单次免疫后ELISA测正痘病毒特异性IgG、斑块减少中和试验（PRNT）测VACV/EEV/MPXV中和抗体；ELISpot与胞内细胞因子染色（ICS）评Th1型T细胞应答；以25×LD₅₀与2.5×LD₅₀ VACV WR鼻内攻毒评估保护，并结合肺组织H&E病理评分。

研究结果

NTV-ΔF1L-C7L恢复MPXV交叉反应抗原表达并触发凋亡

HeLa细胞感染显示VTT稳定表达早/晚期蛋白；NTV晚期蛋白（A27、A33、B5、D8）几乎缺失；NTV-ΔF1L-C7L于16 h即恢复全部五种交叉反应晚期蛋白，24 h达VTT水平。凋亡标志cleaved PARP/caspase-3/8/9在NTV-ΔF1L-C7L组最强，证实F1L缺失解除内源/外源凋亡通路抑制。

NTV-ΔF1L-C7L在多种细胞系中展现强细胞间扩散

斑片免疫染色半定量表明：CEF中NTV-ΔF1L-C7L扩散优于VTT；MRC-5中NTV原株几乎不扩散，而NTV-ΔF1L-C7L接近VTT；Vero、3T3、HeLa中扩散顺序为VTT > NTV-ΔF1L-C7L > NTV。

NTV-ΔF1L-C7L在多样细胞系中支持高效多轮复制

单步（MOI=5）下4 h即产毒，多步（MOI=0.01）72 h内CEF扩增>10⁴倍，MRC-5>10³倍，3T3/HeLa约10²倍，Vero迟缓但最终允许复制；MRC-5中滴度较NTV提升约680倍。

NTV-ΔF1L-C7L呈现良好安全特征

鼻内10⁶ PFU时VTT致>25%减重与死亡，NTV与NTV-ΔF1L-C7L体重波动<4%；10⁷ PFU时VTT 5 d全死，NTV-ΔF1L-C7L仅短暂减重14%后恢复。尾划痕10⁷ PFU NTV-ΔF1L-C7L无结痂，而2×10⁵ PFU VTT即现严重皮损，证实皮肤毒力深度减毒。

NTV-ΔF1L-C7L诱导正痘病毒特异性IgG应答

双剂肌注后，NTV-ΔF1L-C7L各剂量（10⁵–10⁷ PFU）IgG均高于NTV，10⁵ PFU加强后达1.52×10⁴，显著超NTV同量（4.2×10³）；对MPXV六种核心抗原（E3、A29、M1、E8、B6、A35）抗体亦全面占优。

NTV-ΔF1L-C7L诱导强效抗VACV与抗MPXV中和抗体

PRNT显示NTV-ΔF1L-C7L在10⁵ PFU加强后抗VACV GMT较NTV高约7倍，抗EEV（细胞外包膜病毒）同步增强；抗MPXV中和效价与VACV高度正相关（r=0.8472），证明VACV中和可作MPXV替代指标。

NTV-ΔF1L-C7L诱导偏Th1强细胞免疫

ELISpot示E3肽刺激下NTV-ΔF1L-C7L在10⁵–10⁶ PFU诱导IFN-γ斑点显著多于NTV；ICS显示CD8⁺ T细胞分泌IFN-γ、TNF-α上调，IL-4各组的差异无统计学意义，整体呈Th1偏移且优于同量VTT。

NTV-ΔF1L-C7L保护小鼠抵御致死VACV WR攻击

25×LD₅₀ WR攻毒下，10⁵ PFU NTV-ΔF1L-C7L组最大减重约17%、100%存活，与VTT相当，优于NTV（80%存活）；肺病理评分1.67，显著低于NTV（2.33）。

低剂量免疫原性评估

将剂量下探至10³–10⁵ PFU，NTV-ΔF1L-C7L的IgG与中和抗体均超NTV四倍以上；10³ PFU双剂在25×LD₅₀攻毒下100%存活（NTV同量仅60%），2.5×LD₅₀下临床评分远低于NTV。

单次接种保护评估

单剂10⁵ PFU肌注NTV-ΔF1L-C7L，对25×LD₅₀ WR攻毒100%保护且体重恢复快于VTT；2.5×LD₅₀下与VTT（尾划痕2×10⁵ PFU）保护等价。

讨论与结论翻译浓缩

讨论指出，NTV原株因缺C7L在MRC-5等连续细胞系中受SAMD9限制，晚期表达失败；回补C7L解除限制恢复产量，使MRC-5滴度提升680倍，利于脱离原代CEF依赖、转向连续细胞系放大生产。F1L缺失促凋亡产生免疫原性细胞死亡，增强DC交叉提呈与CD8⁺ T细胞应答，与C7L恢复抗原量形成互补。低剂量（10³ PFU）双剂或单剂10⁵ PFU即可完全保护，支持剂量节约策略。安全边际上，NTV-ΔF1L-C7L鼻内10⁷ PFU（VTT致死量10倍）仍100%存活，尾划痕500倍VTT致病量无皮损，减毒源于F1L功能丢失。局限包括需非人灵长类验证、长期保护待查、Clade I a/I b交叉中和未测。

研究结论：NTV-ΔF1L-C7L通过删除F1L与插入C7L，兼顾非复制骨架的安全性与复制型病毒的抗原表达强度，在连续细胞系中产量大幅提升，在小鼠中致病力较VTT降低逾10倍，低剂量或单次肌注即诱导体液（抗VACV/MPXV/EEV中和抗体及六抗原IgG）与Th1偏倚细胞免疫，并对致死WR攻毒提供100%保护，可作为下一代正痘病毒载体与猴痘候选疫苗，论文发表于《Journal of Virology》。