《Analytica Chimica Acta》：Biomonitoring of Parabens and PFAS in Dried Blood Spots: An LC-QqQ-MS/MS approach including free and conjugated species
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人类生物监测需要敏感、可靠且微创的分析策略，以评估对内分泌干扰物的暴露情况。干血斑因具有样本体积需求低、采集简化以及易于储存和运输等优势，在大规模研究中具有重要价值。在本研究中，研究人员开发了一种高通量且绿色的分析方法，用于同时测定通过干血斑采集的人类血液中对
人类生物监测需要敏感、可靠且微创的分析策略，以评估对内分泌干扰物的暴露情况。干血斑因具有样本体积需求低、采集简化以及易于储存和运输等优势，在大规模研究中具有重要价值。在本研究中，研究人员开发了一种高通量且绿色的分析方法，用于同时测定通过干血斑采集的人类血液中对羟基苯甲酸酯（包括游离态和结合态）以及全氟和多氟烷基物质(PFAS)。所提出的方法结合了DBS微采样与微型化的96孔板固相萃取(SPE)程序，随后采用液相色谱-三重四极杆-串联质谱(LC-QqQ-MS/MS)进行检测。该方法已成功验证，显示出良好的线性(R2 > 0.982)和高灵敏度，定量限(LOQ)介于0.01至0.5 μg/L之间，回收率令人满意（在0.05、0.5和5 μg/L水平下为61-120%），精密度值的相对标准偏差(RSD) ≤ 20%。该方法被应用于51份人类DBS样本，结果显示对羟基苯甲酸甲酯(MtP, 5.3-15.1 μg/L)、对羟基苯甲酸乙酯(EtP, 0.4-5.9 μg/L)、对羟基苯甲酸丙酯(PrP, 0.3-4.5 μg/L)、全氟丁酸(PFBA, 0.9-20.2 μg/L)和全氟辛酸(PFOA, 0.4-3.8 μg/L)的检出率为100%。所开发的方法为人类血液中对羟基苯甲酸酯和PFAS的生物监测提供了一个稳健、灵敏、环保且可靠的工具。其较低的样本体积需求、减少的溶剂消耗以及96孔板形式，支持了其在人类生物监测和暴露组学研究中的潜在应用。
在当前的环境与健康研究中，人类面临着前所未有的复杂暴露，其中包括数量庞大的化学污染物。这些污染物中，能够干扰内分泌系统运作的内分泌干扰物(EDCs)因与激素相关疾病密切相关而备受关注。对羟基苯甲酸酯和全氟和多氟烷基物质(PFAS)作为两类典型的EDCs，广泛存在于工业产品、个人护理品及消费品中。对羟基苯甲酸酯作为防腐剂被广泛使用，已被证实具有拟雌激素活性；而PFAS因其极高的化学和热稳定性，在环境中具有持久性和生物累积性，并可能引发内分泌干扰、免疫系统受损等不良健康效应。因此，开展对这些化学物质的生物监测对于建立环境污染物与疾病之间的联系至关重要。传统的生物监测主要依赖静脉采血，但这种技术需要专业人员，且样本量大、预处理繁琐、储存条件苛刻。近年来，干血斑(DBS)等微采样技术因其微创、样本量需求小、储存运输简便等优势，逐渐成为传统采血的有力替代方案。然而，由于DBS样本量有限、血液基质复杂，且需同时分析多种化合物，现有的分析方法在灵敏度和选择性上仍面临挑战。为了解决这些问题，研究人员开发并验证了一种结合DBS微采样与微型化96孔板固相萃取(SPE)的液相色谱-三重四极杆-串联质谱(LC-QqQ-MS/MS)高灵敏度方法，用于同时测定人类血液中的对羟基苯甲酸酯（包括游离态和结合态）与PFAS，该研究成果发表在《Analytica Chimica Acta》上。此研究为评估EDCs暴露提供了一种可靠且微创的策略，对未来大规模暴露组学研究具有重要意义。
在关键技术方法方面，研究人员主要采用了以下几种方法：通过指尖采血收集匿名个体提供的51份干血斑(DBS)样本；采用β-葡萄糖醛酸酶对部分样本进行酶水解以实现对羟基苯甲酸酯结合态的去结合；使用微型化的96孔板固相萃取(SPE)进行样本净化和富集；结合液相色谱-三重四极杆-串联质谱(LC-QqQ-MS/MS)进行多反应监测(MRM)模式的分离与定量分析。
在研究结果部分：
提取方法的评估与优化：研究人员首先系统评估了固液萃取(SLE)和传统固相萃取(SPE)，发现SLE对极性较强的短链PFAS和对羟基苯甲酸酯回收率较低。通过将体系pH调整至5.5并使用Oasis HLB固相萃取，回收率得到显著改善。为实现高通量和绿色分析，最终选择了微型化的96孔板Bond Elut HLB SPE。在条件优化中，研究表明加入洗涤步骤会导致PFAS的严重流失且不能改善对基质共洗脱的去除效果，因此被摒弃。研究人员还发现常压下进行样品加载和洗脱能兼顾两类分析物的回收率，并确定了825 μL MeOH作为最佳洗脱体积，以在保证两组化合物回收率的同时维持高重现性。
DBS对PFAS-蛋白质结合及提取效率的影响：血液中的PFAS常以非代谢形式存在，并与血清白蛋白发生可逆的非共价结合。在DBS形成过程中，干燥、滤纸相互作用及储存条件可能导致蛋白质构象变化。为释放结合态的PFAS，在处理中加入甲醇不仅变性蛋白质释放目标物，还可防止酶解条件下对羟基苯甲酸酯的水解。该方法明确了加入有机溶剂对释放蛋白结合态PFAS的重要性。
分析方法验证：根据国际人用药品注册技术协调会(ICH)指南对方法进行了全面验证。验证结果显示，对羟基苯甲酸酯和PFAS的决定系数分别在0.997和0.982以上。目标分析物的定量限(LOQ)范围在0.01到0.5 μg/L之间，具备极高灵敏度。在三个加标浓度水平下，回收率介在61%至120%之间，日内与日间精密度的相对标准偏差(RSD)均低于20%。方法耐用性、稳定性和残留测试均符合验证标准。此外，与BAGI和AGREEprep评估结果对比，本方法在实用性、高通量和绿色分析方面均表现出显著优势。
样本分析：对采自西班牙阿尔梅里亚Torrecardenas大学医院的51份匿名DBS样本进行分析。对于对羟基苯甲酸酯，共检出MtP、EtP、PrP和BzP。其中，MtP、EtP和PrP的检出率为100%，BzP为39%。数据分析显示，结合态的对羟基苯甲酸酯浓度显著高于其游离态，证实了对结合态进行独立分析的必要性。对于PFAS，除HFPO-DA外其余均有检出。PFBA和PFOA的检出率为100%，且表现为持续、普遍的低至中度背景暴露。而短链PFBA的中位数浓度处于较高水平，提示可能存在对长链化合物的替代性使用和新兴暴露源。PFOS的检出率为24%，PFHxS的极低频检出可能是其较高的LOQ限制了痕量水平的定量。
在讨论与结论部分，研究人员总结指出，本研究成功建立了一个强大且可持续的分析平台，首次实现了对血液样本中游离态及结合态对羟基苯甲酸酯与PFAS的同步监测。采用96孔SPE在确保高灵敏度和高选择性的前提下，有效降低了溶剂消耗和操作复杂性。尽管对结合态的酶处理步骤增加了样本制备时间，但针对50 μL微体积样本，整体工作流程依然可行。基于BAGI评分(75.0/100)和AGREEprep评分(0.63)，本策略展现出极高的实用性、高通量与环境友好性。51份样本的应用分析成功展示了DBS策略在解析不同暴露特征中的初步效能。总之，该DBS工作流程不仅仅简化了血液体积的处理，更是一种融合微创采集、易于储运的整合型分析策略，为未来开展大规模流行病学调查及暴露组学研究提供了极具潜力的绿色替代方案。
