呼吸道合胞病毒A型和B型多重双探针反转录环介导等温扩增检测方法的建立与评估

《PLOS One》：A multiplex dual-probe RT-LAMP assay for rapid subtype-specific detection of respiratory syncytial virus A and B

　　

呼吸道合胞病毒（RSV）是急性呼吸道感染的主要病原，尤其在婴幼儿、老年人及免疫低下人群中危害显著。RSV分为A、B两型，季节性共循环且遗传变异明显，亟需快速、分型特异的诊断方法。反转录定量聚合酶链反应（RT-qPCR）虽为参考标准，但依赖复杂仪器，难以用于去中心化场景。研究人员开发并评估了一种基于探针的反转录环介导等温扩增（RT-LAMP） assay，用于快速检测并区分RSV A与RSV B。该 assay 采用双探针策略：对RSV A使用同化探针（assimilating probe）以保证多重条件下信号稳定，对RSV B及人ACTB基因内标使用杂交型TaqMan式探针（HyTaq probe）。分析性能经系列稀释临床标本与质粒标准品评估；临床性能基于91例RSV A阳性、97例RSV B阳性及120例阴性鼻咽拭子标本评价。结果显示RSV A与RSV B的RT-LAMP灵敏度分别为92.31%和98.97%，两靶标特异性均为100%，且与常见呼吸道病毒无交叉反应。该双探针RT-LAMP assay 为分型特异RSV检测提供了快速、特异的方案，在进一步验证后有望用于去中心化诊断。

研究背景与立项依据

呼吸道合胞病毒（Respiratory syncytial virus，RSV）是全球急性下呼吸道感染的主要病原，对婴幼儿、老年人及免疫低下人群造成显著疾病负担。RSV分为A、B两个主要抗原亚型，在流行季共同循环且附着糖蛋白G基因变异频繁；亚型分布随季节和地域波动，对分子流行病学监测、单抗药物（如靶向融合蛋白的nirsevimab）及老年mRNA疫苗效果评估均有意义。反转录定量聚合酶链反应（RT-qPCR）是当前参考标准，但依赖中心实验室与热循环仪，难以满足资源有限或即时检测需求。环介导等温扩增（LAMP）可在恒温下快速扩增核酸，引入反转录步骤即RT-LAMP，适合近患者检测；然而既往RSV RT-LAMP多依赖嵌入染料或浊度等非序列特异读数，无法在同管中可靠区分A/B亚型（如依退火温度Tm区分因重叠而失败）。探针化策略（同化探针、分子信标、FRET探针、TaqMan式杂交探针）可抑制非特异信号并实现多重荧光分辨。基于此，研究人员在《PLOS One》报道了一种同管三重荧光RT-LAMP assay，用同化探针检RSV A（FAM）、HyTaq探针检RSV B（Cy5）及人ACTB内标（Hex），旨在获得分型特异、带内标验证的等温诊断工具。

主要技术方法概览

研究为回顾性验证，样本源自韩国首尔高丽大学Guro医院2018年1月至2019年7月采集的308份鼻咽拭子（91份RSV A阳性、97份RSV B阳性、120份阴性），参考诊断采用Allplex Respiratory Panel 1。核酸用PowerEXP 32自动提取。多重RT-LAMP以ELPIS 2× Master Mix在62 ℃恒温40 min于CFX96实时荧光仪读数；引物分别靶向RSV A基质（M）基因、RSV B RNA依赖RNA聚合酶（L）基因及人ACTB，探针采用不同化学体系以平衡多重信号。分析灵敏度以质粒标准（10⁰–10⁷拷贝/反应）和临床标本10倍系列稀释评估；交叉反应panel含12种呼吸道病毒、2种临床细菌核酸及3种培养菌；临床性能以灵敏度、特异性、PPV、NPV、准确度及Cohen’s κ计算。

研究结果

优化多重RT-LAMP条件

研究人员测试探针浓度比（1:0.5:1、0.5:1:1、1:1:1）与温度（58、62、65 ℃）。1:1:1比例下三靶标起峰时间一致；62 ℃时RSV A、B及IC的Tt分别为8.53、11.01、12.46 min，较58 ℃显著缩短，故选定62 ℃、1:1:1为最优。

分析灵敏度

质粒标准品中RSV A与B均可稳定检出至1×10⁴拷贝/反应（3/3重复），10³不重复阳性。临床稀释标本中LAMP检RSV A至10^?3、RSV B至10^?4，商业Allplex RT-PCR分别至10^?4与10^?5，即RT-qPCR约高1个对数级，但LAMP在临床相关浓度内可靠。

临床性能

以参考诊断为金标准，LAMP对RSV A灵敏度92.31%（84/91）、特异性100%，对RSV B灵敏度98.97%（96/97）、特异性100%；内标阳性率90/91与96/97。与Allplex SARS-CoV-2/FluA/FluB/RSV相比，RSV A灵敏度略低（94.51% vs 92.31%），RSV B持平（98.97%）。7例RSV A假阴性中3例比较RT-PCR亦阴性，4例含3例高Ct（28.48、29.03、30.69）与1例Ct 21.50，提示假阴性多源于低病毒载量。Cohen’s κ为0.944（A）与0.992（B），近乎完全一致。

交叉反应性

对17种非RSV病原体（12病毒+2临床细菌+3培养菌）三重重复检测，RSV A/B通道均无信号；临床标本IC通道均亮，3种纯培养菌因无人基因组IC不亮，证明靶点特异且无非特异扩增。

讨论与结论翻译

讨论指出，A/B高同源使单管等温分型困难，既往RT-LAMP常放弃分型。本研究将探针荧光读数与单管三重RT-LAMP结合，并在多重中改用同化探针救回RSV A信号（单重HyTaq可行、多重衰减），说明混用探针化学可稳多重等温信号。质粒LOD 10⁴拷贝高于部分文献，但同条件临床头对头显示仅比RT-qPCR低1 log；临床灵敏度接近商业RT-PCR，远优于抗原RDT（60–75%）。局限为单中心回顾性、CFX96非真POCT、需多中心前瞻与便携荧光仪验证。结论：该研究证实了探针化多重RT-LAMP在等温下单管分辨RSV A/B并带ACTB内标的可行性，临床一致性高、操作简捷，为呼吸道病毒多重等温 assay 设计提供实用框架，可作为RT-qPCR的补充用于去中心化分型诊断。