PART、中期阿尔茨海默病和晚期阿尔茨海默病海马神经原纤维缠结的蛋白质组学比较

《Acta Neuropathologica》：Proteomic comparison of hippocampal neurofibrillary tangles in PART, intermediate Alzheimer’s disease and advanced Alzheimer’s disease

　　

阿尔茨海默病（Alzheimer’s disease, AD）的特征是磷酸化Tau蛋白（phosphorylated Tau, pTau）在神经元内聚集形成神经原纤维缠结（neurofibrillary tangles, NFTs），以及β-淀粉样蛋白（β-amyloid, Aβ）在细胞外沉积。局限于海马形成的Tau病理在老年脑中常见，且无任何Aβ沉积，被认为是“原发性年龄相关性Tau蛋白病”（primary age-related tauopathy, PART）。在此，研究人员应用了一种无偏见的蛋白质组学方法，以确定伴随的Aβ病理如何改变神经原纤维缠结的蛋白质组。通过结合显色免疫组织化学与激光捕获显微切割（laser capture microdissection, LCM），研究人员从17例死后脑组织的海马切片中分离出Tau pSer202/pThr205“AT8”免疫阳性神经元轮廓（即神经原纤维缠结），这些样本涵盖三组：PART组（n=5；A0, B1–2, C0评分）、中期AD组（n=6；A1–2, B2–3, C1–2评分）和晚期AD组（n=6；A3, B3, C3评分）。研究人员在Bruker timsTOF质谱仪上采用数据非依赖性采集（data independent acquisition, DIA）模式，进行了基于无标记定量液相色谱-质谱（liquid chromatography–mass spectrometry, LC–MS）的蛋白质组学分析。在所有组别的缠结中，鉴定出一个由63种蛋白质组成的保守核心，基于基因本体论（Gene Ontology, GO）数据库，这些蛋白质主要与“RNA结合”和“mRNA代谢过程的调节”相关。还观察到组特异性特征：33种蛋白质仅在PART病例的缠结中显著富集，主要与“结构分子活性”相关；而Aβ阳性病例则显示出“RNA结合”和“细胞质翻译”通路的特异性富集——其中中期AD病例呈现出过渡性特征。研究人员的发现与PART具有独特缠结蛋白质组特征的观点一致；然而，其大部分蛋白质组特征与AD连续谱系中的缠结相同。通过阐明Aβ积累如何改变缠结蛋白质组，本研究为Tau病理的扩展提供了机制性见解，为识别生物标志物和制定治疗策略铺平了道路，这些策略有望稳定老年人群中的Tau病理。

**研究背景与目的**
阿尔茨海默病（Alzheimer’s disease, AD）是常见的神经退行性疾病，其核心病理特征包括磷酸化Tau蛋白（phosphorylated Tau, pTau）在神经元内聚集形成神经原纤维缠结（neurofibrillary tangles, NFTs），以及β-淀粉样蛋白（β-amyloid, Aβ）在细胞外沉积。Tau病理通常遵循Braak分期，从内嗅皮层逐步扩展至海马和大脑皮层；而Aβ病理则按Thal分期发展。在老年人群中，常观察到局限于海马结构的Tau病理，且无Aβ沉积，此类病例被定义为“原发性年龄相关性Tau蛋白病”（primary age-related tauopathy, PART）。PART是否属于AD连续谱系或独立疾病实体，目前仍存在争议。临床证据表明，PART患者的认知衰退较慢，且与Aβ阳性病例不同；但神经病理学观察提示PART可能为AD的前驱阶段。此外，冷冻电镜（cryo-EM）研究未发现PART与AD的Tau纤维结构差异，但近期蛋白质组学分析提示PART与AD的缠结周围神经元分子特征存在区别。然而，关于Aβ病理如何改变神经原纤维缠结蛋白质组，以及PART与AD在缠结组成上的异同，尚缺乏系统性研究。为此，研究人员开展了一项无偏见的蛋白质组学比较，旨在阐明Aβ积累对Tau病理扩展的影响机制，为生物标志物鉴定和靶向治疗策略提供依据。该研究论文发表在《Acta Neuropathologica》。

**关键技术方法**
研究人员从纽约大学阿尔茨海默病研究中心（NYU ADRC）和马萨诸塞州阿尔茨海默病研究中心（MADRC）获取17例死后脑组织样本，依据ABC评分分为三组：PART组（n=5，A0, B1–2, C0）、中期AD组（n=6，A1–2, B2–3, C1–2）和晚期AD组（n=6，A3, B3, C3）。主要方法包括：①采用抗Tau pSer202/pThr205（AT8）抗体进行显色免疫组织化学，结合激光捕获显微切割（laser capture microdissection, LCM）从海马切片（CA4、CA3、CA2、CA1和下托）中分离AT8阳性神经元轮廓（缠结样本）及相邻神经纤维网区域（非缠结对照样本），每样本收集1.5 mm²总面积；②对提取的肽段进行无标记定量液相色谱-串联质谱（LC–MS/MS）分析，使用Bruker timsTOF HT质谱仪以数据非依赖性采集（data independent acquisition, DIA）模式运行；③蛋白质鉴定与定量基于Spectronaut软件的直接DIA（library-free）模式，设定错误发现率（FDR）为1%，并通过配对t检验比较缠结与非缠结样本的蛋白质丰度差异（fold change≥1.5，p<0.05为显著富集）。

**研究结果**
**1. 海马神经病理学定量**
对Aβ（4G8）、Tau pSer202/pThr205（AT8）、Tau pThr217和Tau pThr231进行免疫组织化学分析。结果显示，Aβ沉积仅见于中期和晚期AD组，确认PART组海马无Aβ病理。Tau病理在三个组别中呈渐进性增加，且在海马亚区（CA4、CA3、CA2、CA1、下托）的分布模式相似，支持Tau病理的连续演变，而非独立特征。

**2. 蛋白质组学概览**
共检测到2413种蛋白质，其中2310种在至少一个组别的一半样本中出现。主成分分析（PCA）显示晚期AD样本与PART样本分离（p<0.001）。配对t检验鉴定出PART、中期AD和晚期AD组中分别有119、111和138种蛋白质在缠结中显著富集。Tau蛋白虽广泛检测到，但未达到显著富集阈值，可能因生理性Tau在非缠结样本中存在；但肽段水平分析确认了pThr217位点磷酸化Tau肽段在缠结中富集。

**3. 共同核心缠结蛋白质组**
在所有组别中，63种蛋白质在缠结中一致富集，构成保守核心。功能富集分析显示，这些蛋白质主要涉及“RNA结合”（58/63）和“mRNA代谢过程调节”（14/63）。其中17种此前被报道为pTau相互作用蛋白，44种已在AD脑蛋白质组数据库（NeuroPro）中记录，仅CCDC124和SUGP2为首次发现。相关性分析表明，各组间蛋白质变化方向高度一致（PART与中期AD：r=0.8205；中期与晚期AD：r=0.8361；PART与晚期AD：r=0.7386），证实缠结蛋白质组具有高度相似性。

**4. Aβ阴性病例（PART）的缠结特异性蛋白质**
33种蛋白质仅在PART组缠结中显著富集，且未被先前报道为pTau相互作用蛋白。功能富集表明这些蛋白质主要参与“结构分子活性”（10/33），包括细胞-细胞外基质相互作用（LAMB2、NID1）、核糖体结构完整性（RPL27A、RPL3、RPS15A等）和蛋白水解过程调节（PI3、TINAGL1）。其中12种蛋白质（如AASS、CPA4、HOXD10等）在NeuroPro数据库中未被报道与AD相关。部分蛋白质（如GRN、NQO1、MAP1LC3B2）在晚期AD组中趋向于降低或缺失，提示这些蛋白质在Aβ病理出现后逐渐下调，可能与神经元防御机制丧失有关。

**5. Aβ阳性病例的缠结特异性蛋白质**
中期AD组有34种蛋白质在缠结中唯一富集，晚期AD组有66种，其中12种为两组共享（如CELF2、DDX39B、EIF3A等）。功能富集分析显示，中期AD组蛋白质主要涉及“RNA结合”（22/34）和“细胞质翻译”（5/34）；晚期AD组则更突出地富集于“细胞质翻译”（24/66），同时部分蛋白质涉及“RNA结合”（5/66）。值得注意的是，晚期AD组中一些蛋白质（如GSTM3、PSMD14、PSMD11、SERPINA3、CTSG）在PART和中期AD组中趋向于降低或未检测到，提示这些蛋白质随Aβ病理加重而逐渐积累，与Tau病理扩展和蛋白质稳态失衡相关。

**讨论与结论**
本研究提供了从PART到晚期AD的神经原纤维缠结蛋白质组全面比较。核心发现包括：①63种蛋白质在所有缠结中共同富集，强调RNA代谢在Tau病理中的核心作用；②PART缠结具有独特的分子特征，33种富集蛋白质主要涉及结构调控，其中部分蛋白质（如GRN、NQO1、MAP1LC3B2）在Aβ出现后减少，提示PART可能依赖溶酶体功能、氧化应激反应和自噬机制维持神经元弹性；③Aβ阳性病例（尤其是晚期AD）的缠结中富集了大量RNA结合和翻译相关蛋白质，伴随着GSTM3、PSMD14/11、SERPINA3和CTSG等蛋白质的上调，这些变化与蛋白质稳态应激和Tau病理扩展相关。研究结论指出，Aβ积累通过重塑缠结蛋白质组，促进Tau病理从海马向脑区扩散，并导致蛋白质稳态崩溃，从而驱动临床良性PART向症状性AD的转变。该研究为区分PART与AD提供了新的分子标志物，并为开发稳定老年Tau病理的治疗策略（如抗Aβ免疫疗法联合靶向蛋白质稳态的干预）奠定了基础。