工程化660 nm响应的Optogenetic Inducer of Pyroptosis用于精准癌症治疗

《Advanced Science》：Engineering a 660 nm-Responsive Optogenetic Inducer of Pyroptosis for Precision Cancer Therapy

　　

诱导肿瘤细胞Pyroptosis（细胞焦亡）是一种有前景的抗癌策略；然而，不受控的Pyroptosis不仅会限制病毒递送载体的生产，还存在全身损伤风险，从而限制了基于Pyroptosis治疗的转化应用。开发能够精确时空控制Pyroptosis的遗传工具仍然具有挑战性。为此，研究人员开发了PyroRACS，一种用于精确Pyroptosis诱导的生物正交Optogenetic（光遗传学）诱导剂。PyroRACS利用工程化的Red-light-activatable Cre-ON genetic switch（RACS，红光激活Cre-ON遗传开关）驱动Gasdermin D N-terminal domain（GSDMDNT，Gasdermin D N端结构域）的表达，能够在不依赖内源性信号通路的情况下可调地启动Pyroptosis。研究人员在多种细胞系中验证了PyroRACS稳健的Pyroptosis诱导能力。PyroRACS表现出高可控性，能在体外以精确时空分辨率选择性消融癌细胞。此外，其优越的可控性使得腺病毒载体的生产成为可能，并允许对PyroRACS进行“all-in-one”递送。在荷瘤小鼠模型中，PyroRACS空间受限的Pyroptosis诱导导致有效的肿瘤抑制，在测试条件下未观察到可检测的全身毒性。总之，PyroRACS为精确操控Pyroptosis提供了一种新颖的Optogenetic工具，促进了基础研究并推动了基于Pyroptosis的精准肿瘤学治疗的发展。

该研究发表于《Advanced Science》。目前基于Pyroptosis（细胞焦亡）的癌症治疗面临核心瓶颈：不受控的Pyroptosis会限制病毒载体生产并引发全身损伤，且现有可控策略多依赖内源性Pyroptotic（焦亡）信号通路，易受肿瘤细胞基因突变、表观沉默及死亡途径串扰影响，蓝光光遗传工具又存在组织穿透浅与光毒性问题。为此研究人员开展本研究，旨在构建不依赖内源性通路、具备高精度时空控制的红光响应光遗传Pyroptosis诱导系统，解决上述转化难题。

研究人员通过开展RACS（Red-light-activatable Cre-ON genetic switch，红光激活Cre-ON遗传开关）的元件筛选与优化、RACS时空基因表达调控表征、PyroRACS介导的Pyroptosis验证、体外肿瘤细胞可控杀伤评估及体内膀胱癌治疗与安全性评价等一系列研究，得出PyroRACS可实现低背景、高特异性的可编程Pyroptosis诱导并在体内外均展现强效抗肿瘤效果且无显著全身毒性的结论，该研究为精准肿瘤学提供了新型光遗传工具，推动了Pyroptosis基础研究与治疗转化。

作者为开展研究用到的主要关键技术方法包括：基于Split Cre重组酶与Phytochrome A（PhyA）/Far-red elongated hypocotyl 1（FHY1）光敏系统的RACS遗传回路设计与组合筛选；采用Dual-floxed inverse orientation（DIO，双翻转反向）策略调控目标基因表达；利用荧光素酶报告系统与Western blot表征基因诱导动力学与蛋白表达；通过Annexin V/Propidium iodide（PI，碘化丙啶）染色、扫描电镜及Damage-associated molecular patterns（DAMPs，损伤相关分子模式）释放检测评估Pyroptosis特征；构建All-in-one腺病毒载体进行细胞感染与荷瘤小鼠（C57BL/6小鼠皮下MB49膀胱癌细胞移植模型、BALB/c nude小鼠模型）体内外治疗与免疫浸润分析；采用Hydrodynamic tail vein injection（流体动力尾静脉注射）与Bioluminescence imaging（生物发光成像）验证体内基因调控；通过血清生化与组织学分析评估系统安全性。

2 Results

2.1 Design of RACS

研究人员通过系统优化PhyA、FHY1与Split Cre片段的空间排布，筛选16种构型并结合Linker肽优化，选定PhyA-CreN59/FHY1-CreC60构型与Linker 4，采用DIO策略与loxP/lox511位点，构建出低背景、高诱导效率的RACS；确定5 μM Phycocyanobilin（PCB，藻蓝胆素）孵育30分钟与660 nm光脉冲（0.5 mW/cm²，20秒）为最优激活条件。

2.2 RACS for Spatiotemporal Control of Gene Expression

研究人员在293T等细胞中表征RACS动力学，发现光照后8小时可检测荧光素酶活性、6小时出现mRNA积累、48小时达峰值；通过Photomask（光掩膜）实现“CS”图案化mCherry表达，证实空间可控性；在MB49荷瘤小鼠与皮下模型中，660 nm光照后生物发光信号显著富集于肺、肝及肿瘤部位，非光照组无背景信号，验证RACS在体内严谨调控基因表达。

2.3 Stringent Optogenetic Regulation of RACS

研究人员将RACS与Minimal CMV promoter、Chemically inducible CreERT2、Blue-light-activated PACre、RedPACre及Far-red-inducible FISC比较，发现RACS基础活性仅为最小启动子的约1.6%，非诱导下EGFP⁺细胞比例0.84%远低于CreERT2的6.47%；RACS诱导倍数约246倍，体内肝脏诱导约104.5倍，显著高于其他光遗传Cre系统，且秒级光照即可激活，背景泄漏极低。

2.4 PyroRACS-Encoded Pyroptosis

研究人员将RACS与GSDMD^NT偶联构建PyroRACS，在GSDMD缺陷的293T细胞中，660 nm光照后表达GSDMD^NT，出现Annexin V⁺/PI⁺染色与质膜气泡状焦亡形态，Pan-caspase inhibitor zVAD-FMK无法阻断死亡，GSDMD^NT抑制剂SCR-1481B1显著减轻死亡，扫描电镜可见质膜孔形成；在HeLa细胞中光照后仅表达外源Flag-GSDMD^NT，内源GSDMD、Caspase-1、Caspase-4、Pro-caspase-3及MLKL（Mixed lineage kinase domain-like protein，混合谱系激酶结构域样蛋白）均无加工或磷酸化，伴随Calreticulin（CRT，钙网蛋白）暴露及HMGB1（High-mobility group box 1，高迁移率族蛋白框1）、ATP、LDH（Lactate dehydrogenase，乳酸脱氢酶）释放，证实PyroRACS诱导不依赖内源性通路的Immunogenic cell death（ICD，免疫原性细胞死亡）。

2.5 Controlled Killing of Tumor Cells by PyroRACS

研究人员构建All-in-one腺病毒PyroRACS，因低背景泄漏获得高产毒粒（1×10¹¹ PFU/mL）；感染膀胱癌细胞5637、BIU87后光照，超过80%细胞发生Pyroptosis并释放ATP、LDH，非光照组无死亡与GSDMD^NT表达；在C17.2神经干细胞与HK-2肾小管上皮细胞中暗处理72小时不影响活力；光掩膜照射严格局限SYTOX Green阳性死亡区于条纹图案内，延长光照时间剂量依赖性增加死亡率，证实体外时空与剂量可控杀伤。

2.6 PyroRACS for Bladder Cancer Therapy With Enhanced Safety

研究人员在C57BL/6小鼠MB49皮下瘤中进行4周期瘤内注射腺病毒加局域660 nm光照治疗，肿瘤生长抑制率达82.5%，瘤重平均下降80.7%，PI染色显示瘤内死亡增加；Flow cytometry显示CD45⁺白细胞增28.52%、CD3⁺ T细胞增55.57%、CD8⁺ T淋巴细胞增28.29%、M1型F4/80⁺CD86⁺巨噬细胞增22.70%；心肝脾肾H&E无损伤，血清ALT、UREA、CK-MB及TNF-α、IL-6、IL-1β均无异常升高，体重稳定，证实局部PyroRACS治疗有效且具良好生物安全性。

讨论部分总结：研究人员指出PyroRACS通过外源表达GSDMD^NT绕过内源性Gasdermin与Caspase依赖通路，避免死亡途径串扰，在GSDMD缺陷细胞仍有效；相比LiPOP2蓝光系统与纳米化学策略，PyroRACS用660 nm红光具更深组织穿透与更低光毒性，DIO与RACS严苛转录调控极大降低GSDMD^NT背景泄漏；相比双AAV策略，All-in-one腺病毒加局域光照提供双重空间门控减少脱靶；但PyroRACS依赖DNA重组与转录翻译故慢于蛋白直接解笼，且不兼容mRNA递送，当前腺病毒免疫原性限制系统递送评估，未来需结合AAV或靶向纳米载体拓展深部肿瘤应用。

结论部分翻译：在本研究中，研究人员开发了PyroRACS，一种红光控制的Optogenetic Pyroptosis诱导剂，其集成了严苛且可调的RACS开关与细胞毒性效应因子GSDMD^NT。PyroRACS能够在不依赖内源性信号通路的情况下实现Pyroptosis的精确时空诱导，即使在Gasdermin缺陷细胞中也能有效触发Pyroptosis，同时避免与其他死亡途径串扰。其优越的可控性与极小的基础泄漏不仅克服了病毒载体生产的挑战，还降低了体内递送过程中脱靶组织损伤的风险，从而潜在改善安全特性。在功能上，PyroRACS在体外展现了稳健的Pyroptosis诱导、局部与可调的肿瘤细胞消融，以及在体内伴随免疫细胞浸润增强的强效抗肿瘤效力，且在处理小鼠中未观察到可检测的全身毒性。总之，PyroRACS建立了一个用于可控Pyroptosis的多功能平台，为机制研究提供了强大工具，并推动了精准肿瘤学治疗的发展。