《Advanced Science》：Tumor-Derived Exosomal circAP2B1 Induces M2 Macrophage Polarization by Enhancing Mitochondrial Homeostasis to Promote Esophageal Squamous Cell Carcinoma Progression
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食管鳞状细胞癌（ESCC）通过外泌体介导的细胞间通讯重塑免疫抑制性肿瘤微环境（TME）。研究人员在该研究中鉴定出环状RNA circAP2B1作为关键调控分子，其在ESCC组织及患者血清中显著上调，并与不良预后密切相关。机制上，肿瘤来源外泌体高效将circAP
食管鳞状细胞癌（ESCC）通过外泌体介导的细胞间通讯重塑免疫抑制性肿瘤微环境（TME）。研究人员在该研究中鉴定出环状RNA circAP2B1作为关键调控分子，其在ESCC组织及患者血清中显著上调，并与不良预后密切相关。机制上，肿瘤来源外泌体高效将circAP2B1递送至肿瘤相关巨噬细胞（TAMs），后者作为独特分子支架同时结合转录因子雌激素相关受体α（ESRRA）与核输入受体KPNA1（Karyopherin Subunit Alpha 1），促进三元复合物形成及ESRRA核转位。入核后ESRRA直接激活线粒体融合关键调节因子Mitofusin 2（MFN2）转录，从而增强线粒体氧化磷酸化（OXPHOS），提高ATP生成效率，建立代谢优化的细胞内环境，最终驱动TAMs向促瘤M2表型极化。体外与体内实验均表明，靶向干预circAP2B1/ESRRA/KPNA1/MFN2信号轴可有效逆转M2极化并显著抑制肿瘤进展。该研究揭示了新型外泌体circRNA介导的代谢-免疫调控通路，为ESCC诊疗提供新途径。
研究背景：食管鳞状细胞癌（ESCC）是全球致死率极高的恶性肿瘤之一，其高度侵袭行为与不良预后亟待新机制阐释。肿瘤微环境（TME）中肿瘤相关巨噬细胞（TAMs）向M2表型极化通过免疫抑制、血管生成及间质重塑促进进展，但外泌体circRNA调控TAM极化的具体机制尚不清楚。已有证据提示外泌体circRNA介导的肿瘤细胞-TAM互作及TAM线粒体代谢重编程与极化表型相关，然而ESCC中特定外泌体circRNA是否及如何经代谢重编程诱导M2极化未明。为此，研究人员开展本研究，旨在鉴定ESCC来源外泌体circRNA并阐明其通过线粒体稳态调控M2极化的分子链路。
主要关键技术方法：研究基于四川人民医院2015至2019年158例ESCC患者手术肿瘤组织、配对正常食管上皮及血清样本与158例健康对照血清，结合circRNA芯片（GSE250413、GSE296251）、单细胞RNA测序（scRNA-seq）、外泌体分离与表征（TEM、NTA、WB标记验证）、PKH26示踪共培养、RNA pull-down、RIP、ChIP、ChIRP、Co-IP、表面等离子共振（SPR）、Seahorse线粒体耗氧率（OCR）检测、流式细胞术及裸鼠皮下成瘤与尾静脉肺转移模型，系统解析分子互作与功能。
研究结果：
3.1 circRNA表达谱与circAP2B1鉴定：通过芯片筛选组织与血清共同上调circRNA，RT-qPCR在158例队列确认circAP2B1（hsa_circ_0004745，382 nt，AP2B1 exon4-5反向剪接）显著高表达，具RNase R抗性、胞质定位，其高表达与TNM分期进展及总生存（OS）缩短相关，多变量Cox回归证实其为独立预后风险因素，血清外泌体circAP2B1的ROC-AUC为0.7631。
3.2 circAP2B1与M2-TAM浸润及ESCC进展关联：组织FISH与多重免疫荧光显示circAP2B1高表达伴随CD68/CD163/CD206阳性M2-TAM增多；scRNA-seq提示circAP2B1-high肿瘤巨噬比例升高且M2特征评分增加；间接共培养中ESCC细胞源外泌体（GW4869可阻）递送circAP2B1促巨噬细胞M2标志（ARG1、IL10、CD163、CD206）上调，并增强TE1细胞增殖、抗凋亡、迁移侵袭及EMT（N-cadherin/Vimentin/Snail/Slug升，E-cadherin/Claudin-1降）。
3.3 肿瘤外泌体circAP2B1诱导M2极化促进展：从KYSE30/TE1上清分离典型外泌体（CD9/CD63/CD81/ALIX/HSP70/TSG101阳性，50-150 nm），PKH26示踪证实巨噬细胞内吞；Exo-circAP2B1处理THP-1提升胞内circAP2B1，上调M2标志，经CD11b/CD206流式确认，且预活化巨噬细胞的旁系条件培养基促KYSE30增殖、抑凋亡、促迁移侵袭与EMT。
3.4 外泌体circAP2B1经增强线粒体稳态促M2：RNA-seq显示Exo-circAP2B1处理巨噬细胞中MFN2显著上调，GO富集于线粒体融合与ATP生成；TEM示线粒体伸长融合，面积/嵴数/长宽比增加；OCR（基础/最大呼吸、ATP产出、备用呼吸容量）与ATP水平升高，ROS降低，膜电位（JC-1）升高，寡霉素可逆转M2标志上调，证实线粒体稳态为M2极化因果上游。
3.5 circAP2B1/ESRRA/KPNA1三元复合物核转位：pull-down+LC-MS/MS锁定circAP2B1结合ESRRA（HR2结构域）及KPNA1，ESRRA截突变定位于1-200 aa；Co-IP证ESRRA-KPNA1互作，FISH-IF共定位三者，circAP2B1增强ESRRA-KPNA1结合，核质分离与FISH-IF示circAP2B1促ESRRA/KPNA1核转位，SPR测circAP2B1-ESRRA/KPNA1复合KD=26.68 μM。
3.6 circAP2B1促MFN2转录：巨噬细胞中circAP2B1过表达升MFN2（mRNA/蛋白），ESRRA或KPNA1敲低取消该效；ChIRP与pull-down定circAP2B1结MFN2启动子-600~-400区（circAP2B1 241-320 nt参与），荧光素酶报告验证；ESRRA/KPNA1/MFN2任一敲低或MFN2抑制剂MFI-8取消circAP2B1所致的ROS降、膜电位升、ATP升与融合增强。
3.7 circAP2B1招募ESRRA至MFN2启动子：ChIP-PCR与pull-down证ESRRA直结MFN2启动子，circAP2B1过表达增强、敲低减弱此结合；JASPAR预测结合基序，ChIP锁定Site 2为功能位点，突变报告基因失活，ESRRA 1-200 aa介导启动子结合。
3.8 体内验证：裸鼠皮下模型示Exo-circAP2B1预活化巨噬细胞促KYSE30成瘤（体积/重量增）、CD163/CD206 TAM浸润增、Ki-67与MFN2升、E-cadherin降/N-cadherin升；GW4869或巨噬KPNA1/MFN2敲低逆转。尾静脉肺转移模型示肺荧光强度与结节数增加，同样被干预逆转。原代TAM分离示线粒体形态/ATP/ROS/膜电位改变与体外一致。
讨论总结：研究人员指出，该研究首次阐明ESCC外泌体circAP2B1作为分子支架桥接ESRRA与KPNA1，经核转位激活MFN2转录、强化OXPHOS与线粒体融合，从而代谢重编程TAM向M2偏移，拓宽了circRNA“非吸附海绵”的脚手架功能认知；与已知circUHRF1、circEML4及circRILPL1-IPO7-YAP等通路并列，凸显外泌体circRNA在瘤-免疫代谢轴中的多样性。研究同时承认局限：裸鼠无T细胞、共注射非自然招募、单中心队列、缺巨噬特异性KO与正交成像。临床层面，血清外泌体circAP2B1兼具无创诊断（AUC 0.7631，联合CEA达0.8723）与靶向代谢-免疫轴治疗双重潜力。
结论部分翻译：本研究阐明了此前未认识的机制——ESCC来源外泌体circAP2B1通过促进TAM的M2极化驱动肿瘤进展。circAP2B1作为分子支架促进ESRRA/KPNA1复合物核转位，激活MFN2转录并增强线粒体稳态，从而营造免疫抑制微环境。这些发现不仅为ESCC诊断提供了新型血清生物标志物，也为靶向肿瘤代谢-免疫轴的治疗策略奠定了概念基础。论文发表于《Advanced Science》。
