水凝胶刚度的原位可编程调控用于阶段适应性骨再生

《Advanced Science》：In Situ Programmable Modulation of Hydrogel Stiffness for Stage-Adaptive Bone Regeneration

　　

骨缺损愈合是一个涉及细胞外基质（ECM）力学性质变化的动态过程，这些变化显著影响细胞行为和组织再生。在该研究中，研究人员开发了一种动态刚度水凝胶系统，旨在模拟骨修复过程中ECM的刚度变化。该水凝胶基于三维互穿聚合物网络（3D IPN），通过在近红外（NIR）照射下诱导的光热效应调节钙离子（Ca²⁺）浓度，从而实现对基质刚度的原位调控。研究表明，水凝胶的动态刚度支持干细胞（SC）维持并促进成骨分化，这与天然骨修复过程中观察到的ECM特征相一致。体外（in vitro）和体内（in vivo）研究均表明，水凝胶系统提供的机械线索显著影响干细胞的干性和成骨潜能。此外，该水凝胶展示了修复临界尺寸骨缺损的能力，凸显了其治疗潜力。这项工作引入了一个结合生物模拟和功能适应性的骨组织工程新平台，以优化骨再生并为未来的临床应用奠定基础。

由创伤、肿瘤切除或先天性疾病引起的大骨缺损在全球范围内仍是一项重大的临床挑战。尽管自体骨移植是临床金标准，但其受限于供区并发症、感染风险及骨源不足等问题。更重要的是，传统的再生医学策略极少考虑骨愈合过程中细胞外微环境的动态演变，这往往导致治疗效果欠佳。骨缺损愈合是一个高度动态的多阶段过程，早期需要柔软的微环境以维持骨髓间充质干细胞（BMSCs）的增殖与多能性，随后微环境逐渐变硬以促进成骨分化和组织成熟。基质刚度是决定BMSCs命运的关键力学信号，而现有的水凝胶支架难以在植入体内后实现精确、原位的刚度时空调控。为了解决这一临床难题并满足骨修复的时间依赖性需求，研究人员开展了一项关于动态刚度可调水凝胶系统的研究，旨在实现阶段适应性的骨再生。该研究成功开发了一种能够在体内按需实现从软到硬转变的水凝胶平台，显著促进了临界尺寸骨缺损的修复。该研究展示了一种将生物模拟与功能适应性相结合的新型智能生物材料平台，可同步支架力学与骨愈合的时间生物学需求，具有重要的临床转化意义，论文已发表在《Advanced Science》。

在关键技术方法方面，研究人员主要采用了以下几种方法：首先，构建了包含甲基丙烯酸酯化明胶（GelMA）、丙烯酰胺（AAm）和聚(N-异丙基丙烯酰胺)（PNIPAm）的共价 primary network，以及由海藻酸钠（SA）与Ca²⁺配位形成的离子 secondary network；其次，合成了由N,N′-双(丙烯酰)胱胺（BACA）表面修饰的金纳米颗粒作为光热触发器，并制备了载有Ca²⁺的温敏性PNIPAm-b-PCL纳米胶束；随后，通过原子力显微镜（AFM）在SD大鼠颅骨缺损模型样本队列中定量测量了天然ECM刚度随时间的变化规律；最后，利用近红外（NIR）照射诱导光热效应和Ca²⁺释放，结合体外细胞生物学实验与体内Micro-CT及组织学评估，验证了该系统的动态力学调节及骨再生能力。

动态硬化水凝胶系统的构建与原理
通过建立大鼠颅骨缺损模型并利用AFM测量，研究人员发现天然ECM刚度在损伤后从第1天的约7 kPa增加到第3天的约23 kPa。基于此力学演变规律，研究人员设计了一种由共价 primary network 和离子 secondary network 组成的三维互穿聚合物网络（IPN）水凝胶。Au@BACA纳米颗粒作为多功能交联剂和光热触发器被引入其中。力学测试表明，通过改变Ca²⁺浓度（0.1%至1%），水凝胶的杨氏模量可从约4 kPa精确调控至39 kPa。在808 nm的NIR照射下，含金纳米颗粒的水凝胶表现出快速升温能力，而生理温度下Ca²⁺泄漏极小，证实了该系统能够重现骨修复中ECM硬度的时间依赖性演变。

动态水凝胶系统的参数调控与理化特性
为实现原位刚度适应性，系统被设计为在NIR照射下，由Au@BACA产生的局部光热效应诱导温敏胶束发生相变并释放Ca²⁺。释放的Ca²⁺增强了SA–Ca²⁺配位网络，使水凝胶刚度从约6 kPa迅速增加至约22 kPa。微观结构分析显示，较高Ca²⁺浓度的水凝胶具有更致密的孔网结构，且表面粗糙度增加，这有利于蛋白质吸附和早期细胞黏附。溶胀实验和压缩测试表明，较低的交联密度产生较高的溶胀率，而该水凝胶的基准硬度在NIR照射前保持稳定，展现出良好的抗疲劳性能和可编程的力学转变能力。

生物相容性
通过活/死染色、CCK-8实验和溶血测试等系统评估了水凝胶的生物相容性。结果表明，在各组水凝胶上培养的BMSCs均保持高活力和增殖活性，Au@BACA纳米颗粒未引起可检测的细胞毒性。细胞骨架染色揭示了依赖刚度的细胞铺展行为：软基质上的细胞铺展面积小且呈圆形，而硬基质上的细胞呈拉伸的纺锤形并伴有增强的F-actin束形成。溶血率均低于1%，证实了该水凝胶系统具有优异的细胞相容性和血液相容性，为后续体内骨修复应用提供了可靠的安全性。

水凝胶刚度对祖细胞维持及相关行为的影响
在早期骨愈合中，维持增殖的多能祖细胞池至关重要。免疫荧光和qPCR分析显示，在动态硬度转变的PNGMSC/Au-NIR组中，Nanog和Oct4等干性基因表达显著高于静态硬基质组，且β-半乳糖苷酶染色的衰老细胞比例更低。相反，硬基质组中细胞周期调节基因上调，加速了细胞周期进程。研究表明，软微环境通过限制YAP/TAZ的核易位来维持细胞于祖细胞状态，而后续的刚度增加则激活机械转导通路驱动成骨分化，证明了基质刚度对BMSCs多能性和命运的强调控作用。

体外动态水凝胶刚度对成骨行为的调节
动态硬化的水凝胶在体外有效实现了从软到硬的微环境原位转变，从而对BMSCs行为进行阶段调控。qPCR显示，动态组的成骨相关基因（RUNX2、ALP、OCN、OPN）表达显著上调。茜素红S染色和ALP染色证实动态组具有最强的钙沉积和基质成熟度。免疫荧光分析进一步确认了该组中RUNX2和OPN表达的大幅增强。机制上，较高的基质刚度促进了细胞骨架张力组装和应力纤维形成，促进YAP/TAZ核转位并上调RUNX2表达，同时激活ERK1/2信号通路，共同加速了成骨成熟和基质矿化。

体内刚度调节促进骨再生
在SD大鼠临界尺寸颅骨缺损模型中评估了NIR介导的原位硬化对骨再生的影响。Micro-CT三维重建和定量分析表明，动态硬化的PNGMSC/Au-NIR组在4周和8周时均表现出最显著的骨体积分数（BV/TV）和骨小梁数量增加。H&E和Masson染色显示，动态组缺损被连续的板层骨填充，成骨细胞沿支架界面排列形成皮质样结构。免疫组化染色进一步证实，动态组中RUNX2和OPN阳性细胞的比例和强度最高。这表明，通过NIR触发的原位硬化能够动态匹配愈合微环境的生物力学需求，从而显著增强临界尺寸缺损的骨再生，且该过程严格依赖于光热激活而非生理温度。

结论部分的讨论与总结指出，本研究开发了一种动态硬化水凝胶，通过将BACA修饰的金纳米颗粒和载钙温敏胶束整合到双互穿聚合物网络中，实现了NIR触发、在生理温度下无法自发发生的体内原位硬化。光热控释的Ca²⁺精确增强了SA–Ca²⁺配位网络。综合研究表明，早期低刚度支持干性维持并防止祖细胞池过早耗竭，而后期刚度增加则促进细胞骨架成熟、成骨信号激活和基质矿化。体内实验证实，该动态水凝胶显著增强了临界尺寸骨缺损中的骨形成和成熟板层骨发育，其效果优于静态软支架和硬支架。该研究构建了一个可编程且具有生物模拟性的材料平台，能够将支架力学与骨再生的自然时间线同步，为治疗难治性骨缺损提供了可临床转化的策略，同时也为基于机械生物学的再生生物材料提供了普适性范式。