垂体神经内分泌肿瘤中CDK5和PBK的双靶点抑制：机制与治疗潜力

《Genes》：Dual-Target Inhibition of CDK5 and PBK in Pituitary Neuroendocrine Tumors: Mechanisms and Therapeutic Potential

　　

背景/目的：垂体神经内分泌肿瘤（Pituitary Neuroendocrine Tumors, PitNETs）常表现出侵袭性行为，使临床治疗复杂化。尽管细胞周期蛋白依赖性激酶5（Cyclin-Dependent Kinase 5, CDK5）和淋巴因子激活的杀伤T细胞来源蛋白激酶（PBK，又称PDZ结合激酶）与肿瘤进展相关，但其相互调控机制尚不清楚。本研究旨在阐明PitNETs中CDK5-PBK相互作用，并发现靶向该通路的潜在治疗药物。方法：研究人员利用邻近标记和磷酸化特异性实验表征PitNET细胞系中CDK5与PBK的相互作用。对患者肿瘤组织进行免疫组织化学分析以评估临床相关性。采用基于人工智能（AI）的虚拟筛选发现双靶点抑制剂。随后通过体外功能实验以及体内异种移植动物模型，评估所鉴定化合物——盐酸氯胍（proguanil hydrochloride）的治疗效果。结果：研究人员发现CDK5（S159位点）与PBK（T9位点）之间的相互磷酸化环路激活胰岛素信号，从而促进PitNETs中细胞增殖和侵袭。患者肿瘤分析显示，磷酸化CDK5（S159）与磷酸化PBK（T9）的共表达与肿瘤侵袭性显著相关（p < 0.001）。通过AI筛选，盐酸氯胍被鉴定为候选双靶点抑制剂。体外实验证实其能有效降低肿瘤细胞生长，而体内异种移植研究验证了其抑制肿瘤进展的能力。结论：CDK5-PBK相互磷酸化轴是PitNETs侵袭性的关键驱动因素。盐酸氯胍是一种有前景的候选双靶点治疗药物，能够破坏该通路以抑制肿瘤生长。

**论文解读：垂体神经内分泌肿瘤中CDK5与PBK的双靶点抑制——机制与治疗潜力**

**研究背景与问题**
垂体神经内分泌肿瘤（PitNETs）是第二常见的颅内肿瘤，占原发性中枢神经系统肿瘤的17.4%，其中35%–60%具有侵袭性，可浸润硬脑膜、骨质或邻近结构（如海绵窦、蝶窦）。侵袭性PitNETs（iPitNETs）因手术全切率低、复发率高，严重威胁患者生存与预后。尽管已有研究指出蛋白激酶在肿瘤行为中起关键调控作用，但驱动PitNETs发病的分子机制仍不明确。前期研究提示细胞周期蛋白依赖性激酶5（CDK5）和淋巴因子激活的杀伤T细胞来源蛋白激酶（PBK，又称PDZ结合激酶）是垂体肿瘤侵袭性的关键介质，但二者之间的相互调节机制尚属空白。此外，现有药物治疗面临瓶颈：多巴胺受体激动剂作为泌乳素瘤的一线疗法，仍有10%–30%患者应答不佳或产生耐药；其他亚型PitNETs的药物选择多限于术后辅助或挽救治疗，亟需新型策略以克服耐药并拓宽疗效。因此，本研究旨在阐明CDK5与PBK在PitNETs中的相互作用，并基于人工智能（AI）筛选靶向该通路的双靶点抑制剂。论文发表在《Genes》。

**主要技术方法**
研究人员采用如下关键技术方法：
1. **TurboID邻近标记技术**：在GH3细胞中表达TurboID-CDK5和TurboID-PBK融合蛋白，通过生物素（biotin）激活标记邻近蛋白，结合液相色谱-串联质谱（LC-MS/MS）鉴定相互作用蛋白质。
2. **AI虚拟筛选与机器学习模型**：从ChEMBL数据库收集CDK5和PBK抑制剂数据集，构建基于分子指纹与分子图的分类模型（包括逻辑回归、随机森林、支持向量机、XGBoost、图卷积网络GCN、图注意力网络GAT和AttentiveFP），筛选FDA批准药物和天然化合物数据库。
3. **体内异种移植模型**：使用BALB/c裸鼠（4周龄雄性，每组5只）皮下接种GH3细胞，评估基因敲低和药物（盐酸氯胍）对肿瘤生长的抑制作用。
4. **临床样本分析**：纳入73例PitNET患者肿瘤组织芯片，通过双重免疫荧光染色检测p-CDK5(S159)和p-PBK(T9)共表达，结合术前MRI体积与Knosp分级评估侵袭性相关性。

**研究结果**

**3.1 CDK5与PBK在PitNET细胞系中的相互磷酸化**
在GH3细胞中，通过shRNA敲低CDK5导致PBK磷酸化水平显著降低；反之，敲低PBK也降低CDK5磷酸化。结合数据库预测与AlphaFold3结构建模，鉴定CDK5的S159位点为PBK的潜在磷酸化靶点。实验验证：PBK敲低后，p-CDK5(S159)水平下降，证实CDK5与PBK存在双向磷酸化调控。

**3.2 利用TurboID邻近标记探索相互激酶相互作用与底物激活机制**
在GH3细胞中建立FLAG-TurboID-CDK5和FLAG-TurboID-PBK过表达模型，优化生物素激活浓度（CDK5为500 μM，PBK为100 μM）。LC-MS/MS鉴定邻近标记蛋白，基因集富集分析（GSEA）显示胰岛素信号通路为CDK5和PBK共同的显著富集通路，提示IRS1可能是二者的共同下游底物。

**3.3 CDK5和PBK通过胰岛素信号通路调控PitNET细胞增殖与存活**
构建CDK5和PBK单敲除、双敲除及过表达的GH3细胞系，进行RNA测序与KEGG富集分析，确认胰岛素信号通路是主要靶点。免疫印迹显示，CDK5和PBK敲低降低IRS1和mTOR的磷酸化水平。集落形成实验显示，PBK敲低和双敲低减少集落形成；体内异种移植实验中，单基因敲低显著降低肿瘤重量（shCdk5组68.14 mg，shPbk组61.62 mg vs. shMock组146.6 mg，p<0.0001），双敲低进一步降低至23.52 mg（p<0.0001）。

**3.4 p-CDK5(S159)与p-PBK(T9)共表达与临床样本肿瘤侵袭性的关联**
对73例PitNET组织芯片进行双重免疫荧光染色，定量p-CDK5(S159)和p-PBK(T9)双阳性率。Spearman相关分析显示，双阳性率与肿瘤体积（Rs=0.5080，p<0.001）和Knosp分级（Rs=0.3789，p<0.001）显著正相关。

**3.5 利用AI筛选和机器学习模型鉴定CDK5与PBK双靶点抑制剂**
基于ChEMBL数据库构建15种预测模型，其中图卷积网络（GCN）模型表现最优：CDK5-GCN在验证集AUC=0.9218，PBK-GCN AUC=0.8333。应用该模型筛选FDA批准药物和天然化合物数据库，选取预测置信度>0.6的化合物，排名前10的FDA药物和前9的天然化合物进入后续评估。

**3.6 化合物5（盐酸氯胍）抑制垂体肿瘤细胞增殖的机制与效能**
对19种候选化合物进行初步细胞毒性筛选，确定4种具有显著抑制活性。盐酸氯胍在GH3和MMQ细胞中的IC₅₀分别为6.855 μM和8.133 μM。敲低CDK5或PBK后，IC₅₀升高（GH3 shCdk5: 23.29 μM，shPbk: 19.48 μM），证实靶点特异性。Western blot显示盐酸氯胍降低p-CDK5(S159)和p-PBK(T9)水平。该药物升高cleaved caspase-3表达和活性氧（ROS）水平，集落形成实验表明其抑制效果可被ROS清除剂NAC或泛caspase抑制剂ZAD部分逆转，提示通过ROS依赖性凋亡发挥作用。

**3.7 盐酸氯胍在体内抑制垂体肿瘤生长**
GH3异种移植模型中，盐酸氯胍治疗组肿瘤重量（44.9±14.0 mg）显著低于对照组（171.2±20.2 mg，p<0.0001）。对6例患者来源原代PitNET细胞（包括GH分泌型、PRL分泌型、沉默促肾上腺皮质激素细胞型、TSH分泌型）进行IC₅₀测定，范围为3.61–12.89 μM，显示不同亚型敏感性差异。

**讨论与结论**
本研究首次揭示CDK5与PBK之间的相互磷酸化机制，通过激活胰岛素信号/IRS1-mTOR轴驱动PitNET进展。通过AI药物筛选发现盐酸氯胍作为候选双靶点抑制剂，在体外和体内均展现出抗肿瘤活性。p-CDK5(S159)和p-PBK(T9)的共表达可作为临床侵袭性生物标志物，桥接分子机制与诊断应用。该研究填补了CDK5-PBK-IRS1信号枢纽及其在代谢重编程中作用的认知空白，为克服单靶点治疗中补偿性激酶激活的局限性提供了新策略。研究结论：本研究揭示了CDK5与PBK之间的相互磷酸化关系，该关系关键调控下游信号通路（包括IRS1和mTOR轴）于PitNETs中。p-CDK5(S159)和p-PBK(T9)共表达与肿瘤侵袭性显著相关，提示其可作为侵袭性PitNET表型的生物标志物。此外，基于AI的筛选鉴定出盐酸氯胍为CDK5和PBK的双靶点候选抑制剂，通过抑制胰岛素信号/IRS1-mTOR轴发挥显著抗肿瘤效应。这些发现为PitNET进展的分子机制提供了新见解，并提出了一种靶向CDK5-PBK轴的有前景的治疗策略。