通过整合二代测序（NGS）与纳米孔测序（Nanopore sequencing）方法解析急性髓系白血病（AML）中的BAX与BCL2L12 circRNAs

《Genes》：Deciphering BAX and BCL2L12 circRNAs in Acute Myeloid Leukemia Through an Integrated Next-Generation and Nanopore Sequencing Approach

　　

环状RNAs（circRNAs）构成了一个新兴的研究领域，因为这些RNA分子在细胞功能和各种人类病理学的进展中起着至关重要的作用。对于由同一初级转录本形成的不同circRNAs的选择性环化，具有略微不同的反向剪接连接（BSJs）从而导致非常相似的circRNA序列（称为circRNA isoforms）的作用，以及同一初级转录本在多大程度上产生选择性circRNAs，目前知之甚少。在这项研究中，研究人员发现了在起源于骨髓增生异常综合征（MDS）和不同类型的急性髓系白血病（AML）的已建立的人类细胞系中表达的两个细胞凋亡相关基因BAX和BCL2L12产生的选择性circRNAs。在从一种MDS细胞系和五种AML细胞系中提取总RNA、合成第一链cDNA并使用在BAX和BCL2L12基因的每个外显子中退火的不同套发散引物（分别为BAX和BCL2L12 circRNAs的10和16对引物）进行多重巢式PCR之后，研究人员制备了扩增子文库，并通过纳米孔测序和NGS进行了测序。随后，基于现有的生物信息学工具和研究人员自己的算法进行了详细的生物信息学分析。研究人员的方法导致在MDS和AML细胞系中鉴定出72个具有不同表达模式的BAX circRNAs和52个BCL2L12 circRNAs。这些circRNAs中的大多数（无论是仅含外显子的还是外显子-内含子的）都是首次被检测到。此外，在一个独特的细胞系中检测到了几种BAX circRNA亚型。而且，在许多情况下，连接在一起形成每个circRNA的BSJ的反向剪接位点是经典的。已鉴定的circRNAs被预测可海绵吸附不同的miRNAs，其中一些已知可调节关键通路的活性。总的来说，研究人员的发现支持了这样一种观点，即选择性剪接和反向剪接导致同一人类基因产生数十种不同的circRNAs。

急性髓系白血病（AML）是一种侵袭性的造血干细胞疾病，其特征是异常且分化差的髓系祖细胞发生克隆性过度增殖，这些恶性转化会破坏正常的骨髓功能并导致造血功能衰竭。AML的进展通常十分迅速，并且涵盖了一系列高度异质性的分子和细胞遗传学亚型，这些亚型决定了患者的临床预后和治疗策略。与AML密切相关的是骨髓增生异常综合征（MDS），这是一种前白血病克隆性疾病，其特征是外周血细胞减少、无效的造血以及向AML转化的高风险。这两种恶性肿瘤具有复杂的分子机制，由 disrupted 的表观遗传修饰、组蛋白改变、异常的pre-mRNA剪接以及改变的转录因子网络所驱动。在MDS和AML的发病机制和进展中，一个关键的决定因素是造血细胞增殖与程序性细胞死亡之间平衡的失调。细胞凋亡作为程序性细胞死亡的主要机制，受BCL2蛋白家族通过内在线粒体途径的严格调控。因此，这些蛋白已成为血液系统恶性肿瘤中重要的预后生物标志物和治疗靶点。BCL2L12作为BCL2家族中结构独特的成员，在白血病和淋巴瘤等不同类型的癌症中均被证实具有显著的转录复杂性，可产生超过50种选择性剪接变体，且其在恶性细胞中的差异表达提示其在肿瘤细胞存活中具有依赖环境的功能作用。BAX则作为该家族中起核心作用的促凋亡执行者，其失调在髓系恶性肿瘤中也有广泛的记录。然而，目前对于与细胞凋亡相关的circRNAs在髓系恶性肿瘤中的选择性剪接、多样性及具体病理作用仍然知之甚少。传统的短读长大规模并行测序通常难以完全解析全长circRNAs复杂的内部结构。鉴于BAX和BCL2L12在内在凋亡途径中的重要调节作用，研究人员旨在全面描绘这两个关键基因位点的circRNA图谱。该研究论文发表在《Genes》期刊上，为髓系疾病的非编码RNA转录组图谱提供了新的见解。

在关键技术方法方面，研究选用了1个MDS细胞系（MDS-L）和5个AML细胞系（HL-60、NB-4、Kasumi-1、MOLM-13和U-937）作为样本队列来源。研究人员从各细胞系中提取总RNA并反转录为cDNA。随后，针对BAX和BCL2L12基因的每个外显子设计了特定的发散引物对，通过多重巢式PCR特异性扩增circRNAs。研究人员将获得的PCR扩增子构建为带条形码的文库，结合了具有单核苷酸精度的短读长二代测序（NGS）与提供结构分辨率的三代纳米孔长读长测序技术。最后，利用现有的生物信息学工具结合研究人员团队自主开发的算法（如ASDT算法）对测序数据进行比对、可视化及结构解析，并通过miRDB预测了靶向miRNA及相关的蛋白编码基因调控网络。

在研究结果部分，研究人员的发现如下：

外显子结构与鉴定出的BAX和BCL2L12 circRNAs的特征：通过整合纳米孔测序与NGS技术，研究人员在MDS和AML细胞系中鉴定出了72个BAX circRNAs和52个BCL2L12 circRNAs。大多数此类环状转录本是首次被检测到，其中部分circRNAs包含了仅含单一外显子的结构。值得注意的是，研究人员发现了一个包含此前从未被描述过的新外显子的circRNA（circ-BCL2L12-65）。此外，形成大多数circRNAs反向剪接连接（BSJ）的反向剪接位点多是非经典的。只有极少数的circRNAs（如circ-BAX-42等）拥有经典的剪接位点（GU/AG或GC/AG）。另一个有趣的发现是，包含非经典反向剪接位点的基因组区域具有局部短序列同一性（通常为4-10个核苷酸）。令人惊讶的是，研究人员还在2个BCL2L12 circRNAs（circ-BCL2L12-7和circ-BCL2L12-70）中发现了一个poly(A)片段，该片段在环化过程中被直接连接到了截短的5'端外显子上形成BSJ。

BCL2L12和BAX circRNAs在MDS和AML细胞系中的表达谱分析：研究揭示了BAX和BCL2L12 circRNAs在各个细胞系中呈现出截然不同的表达谱。在检出的72个BAX circRNAs中，有61个在至少一种AML细胞系中表达，25个在MDS-L细胞系中表达。而在52个BCL2L12 circRNAs中，47个在AML细胞系中表达，18个在MDS-L细胞系中表达。绝大多数检测到的circRNAs属于外显子circRNAs（EcircRNAs），仅有少数为外显子-内含子circRNAs（EIcircRNAs）。研究还观察到一些具有相同外显子组成但BSJ位点存在微小差异的circRNA isoforms。部分BAX circRNA isoforms在同一个细胞系中共表达，而其他的则表现出明显的细胞系特异性。

靶向miRNAs的预测及其对蛋白编码基因表达的影响：生物信息学分析表明，研究人员所鉴定出的BAX和BCL2L12 circRNA序列被预测能够结合并海绵吸附多种特定的miRNAs。这些miRNAs极有可能参与调控AML中活性发生异常的关键信号通路中的核心蛋白表达，包括Jak-STAT、MAPK、PI3K-Akt、mTOR、细胞周期以及转录过程等。基于此，研究人员推测，由这些circRNAs作为竞争性内源RNAs海绵吸附miRNAs所引发的间接调控，可能影响了RAS超家族成员、MAPKs、PI3K催化亚基、细胞周期蛋白及多种转录因子的表达。

在讨论与结论部分，研究人员指出，鉴于选择性剪接在转录组和蛋白质组多样性中的核心作用，其异常被认为是癌症发展的关键事件。通过结合互补的测序技术，研究人员以极高的精度和分辨率捕获了新的剪接连接和复杂的内部结构细节。研究中鉴定出的非经典BSJ的高出现频率挑战了关于RNA环化需求的常规假设，表明可能存在不依赖于经典反向剪接信号而运行的替代机制。对于广泛存在的内含子保留现象，研究推测部分内含子保留的circRNAs（EIciRNAs）可能主要定位于细胞核中调节其亲本基因的转录。由于细胞凋亡失调是MDS向AML进展的标志，研究人员提出，由这些新型circRNAs通过竞争性剪接或miRNAs海绵吸附介导的对线性凋亡转录本的调节，可能在疾病进展中发挥了未被发掘的作用。

最后，研究人员总结了研究结论：他们成功鉴定了72个BAX和52个BCL2L12 circRNAs，这些circRNAs在MDS和AML细胞系中表现出截然不同的表达模式。这些分子中的大多数是首次被报道，其中几个BAX isoforms表现出细胞系特异性表达。更为关键的是，很大一部分被识别出的circRNAs是通过非经典剪接位点的反向剪接形成的。综合而言，研究人员的发现强有力地支持了这样一个观点：选择性剪接和反向剪接共同促成了同一人类基因产生数十种各不相同的circRNAs。这些结构基础的揭示，将为未来开发通过直接RNA干扰或调节环化生成以恢复髓系恶性肿瘤细胞凋亡敏感性的治疗策略提供重要理论支撑。