基于滚环扩增触发的环介导等温扩增与原位荧光信号转导的一管式APE1检测方法

《Analytica Chimica Acta》：Rolling circle amplification-triggered loop-mediated isothermal amplification and in-situ fluorescence signal transduction for one-tube APE1 sensing

　　

摘要

背景

分子诊断依赖于通过高效的信号放大和便捷的信号转导来实现准确且灵敏的生物标志物检测。作为一种有前景的放大策略，等温聚合反应为生物医学分析提供了出色的结构稳定性和放大效率。与需要外部信号调节的传统荧光剂不同，基于DNA模板的铜纳米颗粒能够实现内源性的信号传导机制。可以合理推断，等温聚合放大与基于DNA模板的铜纳米颗粒介导的信号转导机制十分兼容，这种机制能有效抑制信号泄漏，提升检测的可靠性和精确度。

结果

我们开发了一种基于滚环扩增触发环介导等温扩增，并结合荧光DNA模板铜纳米颗粒实现内源信号转导的一管式超灵敏脱嘌呤/脱嘧啶内切酶1检测方法。当目标识别探针被APE1特异性切割后，线性引物会被释放并立即触发滚环扩增反应。由此产生的长链产物会促使发夹引物聚合形成种子DNA，这些种子DNA在相同聚合酶的持续催化下进一步引发环介导等温扩增反应。最终产生的大量双链DNA产物，由于AT富集序列上会原位生成铜纳米颗粒，从而实现高效的荧光信号输出。这种简化的操作流程使得APE1检测既简单又灵敏，检测限低至3.1×10^-4 U/mL。此外，该方法还具备出色的选择性和抗干扰能力，可通过检测细胞中的APE1明确区分肿瘤细胞与正常细胞。

意义

由于该检测策略具有模块化设计，只需对识别模块进行相应改造，即可用于检测其他DNA修复酶，这体现了其极高的检测灵活性，也为先进分子诊断技术的应用带来了广阔前景。总体而言，这项工作为聚合反应驱动的信号放大与信号转导机制的无缝整合提供了一种新思路，为开发简单高效的生物传感器带来了新的可能。

引言

基因组的完整性与稳定性主要依靠DNA修复酶来维持，这些酶能够识别并修复受损的DNA结构。作为DNA修复酶家族中的重要成员，脱嘌呤/脱嘧啶内切酶1能够特异性识别并切除DNA损伤过程中产生的脱嘌呤/脱嘧啶位点[1]。该酶在肿瘤细胞中通常表达水平较高，因此成为癌症研究与临床诊断中极具潜力的生物标志物[2]、[3]。鉴于APE1在细胞内的含量较低，且其催化活性容易受到复杂生物环境的干扰，因此亟需开发高灵敏度的检测方法，这对于推动基于APE1的分子诊断技术的发展至关重要。近年来，DNA扩增技术已成为高灵敏度生物医学分析领域中信号放大策略发展的主流，这类技术也为基于底物DNA切割的APE1检测带来了诸多技术优势[4]、[5]、[6]、[7]、[8]。尽管目前针对APE1检测的研究已取得一定进展，但为了满足分子诊断应用的需求，仍需进一步开发更为简单灵敏的检测方法。

聚合酶依赖型扩增是一种成熟可靠的DNA扩增技术，其中PCR是最具代表性的方法。PCR具有较高的扩增效率和特异性，但也存在操作耗时较长且需要热循环的缺点[9]。由于在分子诊断领域的广泛应用，等温扩增策略近年来受到了广泛研究关注[10]。聚合酶催化的等温DNA扩增包括多种策略，如链置换扩增、重组酶聚合酶扩增、滚环扩增、核酸序列依赖性扩增、环介导等温扩增以及解旋酶依赖型扩增等。值得注意的是，这些聚合酶驱动的扩增方法大多单独使用，或与非聚合酶型的DNA扩增策略结合使用，而将不同聚合反应整合在一起的系统由于引物设计复杂以及不同聚合酶之间的不相容性，至今仍较为少见。因此，经过合理设计的级联聚合扩增策略有望推动等温扩增技术的创新与发展。

除了信号放大之外，信号转导也是分子传感技术的重要组成部分。通过生物分子引导合成发光金属纳米材料，可以将生物分子与发光剂直接连接起来，这为纳米尺度生物传感中的信号转导奠定了基础[25]。金纳米团、银纳米团以及铜纳米颗粒/纳米团等荧光金属纳米材料，正在逐渐取代传统的有机荧光染料和合金量子点，成为生物医学分析领域中的优质替代品[26]、[27]、[28]。作为更优的选择，荧光铜纳米颗粒/纳米团具有诸多独特优势，比如合成路线简单、反应条件温和、材料成本较低，且生物相容性优异[29]、[30]。除此之外，基于DNA模板的铜纳米颗粒还具有合成时间短（小于5分钟）、斯托克斯位移大（大于240纳米）以及对DNA序列依赖性高等特点[31]、[32]。更重要的是，基于DNA模板的铜纳米颗粒的后期处理策略能够有效消除传统预标记信号源对DNA杂交及扩增过程的负面影响[33]。正是由于这些优势，基于DNA模板的铜纳米颗粒成为了纳米生物传感中理想的信号转导物质。虽然基于DNA模板的铜纳米颗粒在针对多种分析物的生物传感应用中已经取得了显著进展[34]、[35]，但将其与等温信号放大策略结合用于APE1检测的研究仍处于起步阶段，还需要进一步深入系统的研究。

在此，我们设计了一种基于滚环扩增触发环介导等温扩增的级联聚合扩增策略。该策略通过单一聚合酶在一锅一步的反应中依次催化滚环扩增和环介导等温扩增反应，不仅操作简便，如同普通的扩增方法，而且扩增效率大幅提升。通过进一步将滚环扩增触发的环介导等温扩增与基于DNA模板铜纳米颗粒的荧光信号转导相结合，我们成功实现了超灵敏的APE1检测。这种简化的检测流程使得APE1检测能够在均匀体系的一管式中完成。该检测方法具有较高的选择性和较强的抗干扰能力，通过检测细胞中的APE1，还能够清晰地区分肿瘤细胞与正常细胞。此外，通过合理设计目标识别模块，这种信号放大和转导模块还可用于检测其他多种DNA修复酶，展现出极高的灵活性和实用性。

章节节选

材料与设备

所有寡核苷酸均由上海桑根生物技术有限公司合成并通过HPLC纯化，其详细序列见补充信息中的表S1。APE1、NEBuffer? 4（20 mM Tris-HAc、50 mM KAc、10 mM Mg(Ac)₂、1 mM DTT，pH=7.9）、Bst 2.0 DNA聚合酶以及等温扩增缓冲液（20 mM Tris-HCl、10 mM (NH₄)₂SO₄、50 mM KCl、2 mM MgSO₄、0.1% Tween 20，pH=8.8）均购自北京新英格兰生物技术公司。T4 DNA连接酶以及

基于滚环扩增触发环介导等温扩增的APE1检测原理

图1展示了基于滚环扩增触发环介导等温扩增以及荧光铜纳米颗粒介导的信号转导机制的APE1检测原理。首先，目标APE1会特异性识别并切割位于stem-loop结构APE1探针（pAPE1）茎段中的脱嘌呤/脱嘧啶位点，从而释放出线性引物。该线性引物随后与环形模板结合，在Bst 2.0 DNA聚合酶的催化下启动滚环扩增反应。之后，发夹引物会依次结合到长链产物上

结论

综上所述，我们开发了一种基于滚环扩增触发环介导等温扩增以及基于DNA模板铜纳米颗粒的荧光信号转导机制的一管式超灵敏APE1检测方法。该检测方法通过单一聚合酶在一步反应中实现级联等温聚合扩增，从而在较高的扩增效率与简单的操作流程之间取得了良好平衡。通过将基于聚合反应的信号放大机制与基于生成反应的信号转导机制无缝整合

CRediT作者贡献说明

梁欣颖：方法设计、数值分析、数据整理。尚玉辉：论文初稿撰写、方法设计、数据整理、概念构思。陈金阳：论文审阅与编辑、实验指导、资源提供、资金获取、概念构思。刘雅丽：软件应用、数值分析

利益冲突声明

? 作者声明不存在任何可能影响本文研究结果的已知财务利益关系或个人关系。

致谢

本研究得到了中国国家自然科学基金（编号：22004031）以及湖北省自然科学基金（编号：2023AFB996）的支持。

尚玉辉|梁欣颖|刘雅丽|陈金阳

中国湖北省黄石市435002，湖北师范大学化学与化工学院，污染物分析与再利用技术湖北省重点实验室