《Behavioural Brain Research》：Falls Induced by Optogenetic Inhibition of Basal Forebrain Cholinergic Neurons after Dorsomedial Striatal Dopamine Depletion in a Dual Disruption Model of Falling Vulnerability in Parkinson Disease
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跌倒是一种常见且使帕金森病（PD）患者衰弱的特征。前额叶乙酰胆碱（ACh）缺陷以及黑质纹状体多巴胺缺陷与跌倒易感性有关。与无皮质ACh丧失的PD患者相比，伴有皮质ACh丧失和相关认知功能障碍的PD患者跌倒率更高。此外，在大鼠中，化学遗传学抑制基底前脑（BF）神
跌倒是一种常见且使帕金森病（PD）患者衰弱的特征。前额叶乙酰胆碱（ACh）缺陷以及黑质纹状体多巴胺缺陷与跌倒易感性有关。与无皮质ACh丧失的PD患者相比，伴有皮质ACh丧失和相关认知功能障碍的PD患者跌倒率更高。此外，在大鼠中，化学遗传学抑制基底前脑（BF）神经元会增加在平衡木任务中跌倒的易感性。在此，研究人员评估了在背内侧纹状体多巴胺损伤的大鼠中，使用密歇根复杂运动控制任务（MCMCT）穿越直或Z形平衡木时，瞬时光遗传学特异性抑制BF胆碱能神经元的影响。在纹状体多巴胺损伤的基础上，加入瞬时光遗传学抑制BF胆碱能神经元，使跌倒率高于单独纹状体多巴胺损伤或BF ACh抑制所导致的水平，尤其是在具有挑战性的Z形任务中。这些结果支持BF-皮质胆碱能回路在缓解具有纹状体多巴胺丧失的PD患者跌倒易感性中的关键作用，表明正是BF胆碱能活性和纹状体多巴胺的联合丧失导致了最大的跌倒易感性和相关的复杂运动障碍。
**论文解读：光遗传学抑制基底前脑胆碱能神经元在帕金森病双重系统破坏模型中诱导跌倒易感性的研究**
**研究背景与问题**
帕金森病（PD）是一种多系统神经退行性疾病，涉及多种神经递质系统的改变。背侧纹状体多巴胺（DA）丧失是导致PD特征性运动障碍的主要神经递质缺陷，而胆碱能系统的变化也在疾病病理生理中起关键作用。伴有区域性胆碱能缺陷的PD患者常出现认知功能下降以及左旋多巴抵抗性运动障碍，如步态受损、平衡和姿势不良，且跌倒倾向显著高于无胆碱能丧失的PD患者。跌倒对PD患者和老年人而言是危险的，且是导致死亡的主要原因，尤其是伴有认知衰退的患者。基底前脑（BF）的胆碱能输出，特别是投射到前额叶皮层的通路，调控认知过程，包括检测和整合引导复杂运动所需的线索。BF-皮质胆碱能通路的退化会导致人类和啮齿类动物的认知功能下降。既往研究已在大鼠中建立了双重系统破坏模型，通过结合纹状体6-羟基多巴胺（6-OHDA）注射导致的背侧纹状体DA终末部分丧失和BF损伤导致的皮质ACh丧失，在大鼠穿越具有挑战性的平衡木任务（密歇根复杂运动控制任务，MCMCT）中表现出更高的跌倒倾向，并伴有持续注意任务（SAT）表现下降。此外，利用化学遗传学方法（DREADDs）可逆地抑制BF神经元，也能诱导跌倒，尤其是在具有更认知引导运动控制的大鼠中。然而，先前研究存在非特异性抑制BF神经元的问题，且未能明确区分胆碱能神经元在其中的作用。因此，本研究旨在通过结合选择性胆碱能BF神经元的光遗传学抑制和背侧纹状体DA耗竭，在亚秒时间尺度上验证并扩展双重系统破坏对跌倒易感性的影响，并评估不同认知策略（目标追踪者GT与信号追踪者ST）的差异。
**研究目的与意义**
研究人员开展了光遗传学抑制BF胆碱能神经元联合背内侧纹状体DA耗竭的实验，以明确双重系统破坏对跌倒易感性的具体贡献。该研究发表在《Behavioural Brain Research》。结果表明，双重系统破坏（特别是结合BF胆碱能抑制和纹状体DA耗竭）显著增加了大鼠在复杂平衡木任务中的跌倒，尤其是在Z形旋转杆上，而单独系统破坏则未达到显著水平。这证实了BF-皮质胆碱能回路在缓解PD患者跌倒易感性中的关键作用，并提示同时丧失BF胆碱能活性和纹状体DA是导致最大跌倒易感性的原因。该研究为理解PD患者跌倒的神经机制提供了重要依据，并支持胆碱能增强疗法可能成为缓解PD患者跌倒和步态障碍的辅助治疗。
**关键技术与方法**
本研究使用了以下主要关键技术方法：
1. **动物模型与分组**：使用ChAT-Cre杂合子Long-Evans大鼠（源自斯坦福大学，与Envigo的野生型雌鼠杂交，经Transnetyx基因分型）。通过巴甫洛夫条件性接近（PCA）筛选，将大鼠分为目标追踪者（GT）和信号追踪者（ST）。共57只大鼠（27 GT，30 ST）被伪随机分为三组：双重ACh/DA破坏组（抑制性AAV + 6-OHDA纹状体损伤）、仅ACh破坏组（抑制性AAV + 假手术纹状体）和仅DA损伤组（对照AAV + 6-OHDA纹状体损伤）。
2. **光遗传学抑制**：采用无线LED光遗传学系统（Teleopto Wireless Optogenetic Stimulator System，Amuza Inc.），在大鼠BF区域植入定制的470 nm LED光纤套管，向BF胆碱能神经元传递抑制性光脉冲（1秒脉冲或连续刺激）。病毒载体为pAAV-nEF-Con/Foff 2.0-iC++-EYFP（氯离子通道视紫红质），通过立体定位注射至BF，以表达Cre依赖的抑制性光敏感蛋白。
3. **多巴胺耗竭**：通过双侧6-OHDA（Sigma-Aldrich）注射至背内侧纹状体（两个位点）实现DA终末损伤，并用去甲肾上腺素再摄取抑制剂设计普利明保护去甲肾上腺素能神经元。
4. **行为学测试**：使用密歇根复杂运动控制任务（MCMCT），包括直旋转杆和更复杂的Z形旋转杆。大鼠在有无LED抑制（1秒脉冲或连续抑制）条件下进行穿越，记录跌倒次数和穿越时间。
5. **组织学分析**：通过免疫组化染色（抗GFP、抗VAChT、抗TH）评估AAV转染效率、BF胆碱能神经元共标记情况以及6-OHDA诱导的TH耗竭程度。使用共聚焦显微镜和ImageJ进行细胞计数，并对TH损伤大小和位置进行评分。
**研究结果**
**3.1. 直旋转杆，1秒LED抑制脉冲**
在直旋转杆上，1秒LED抑制脉冲总体上增加了跌倒（刺激效应显著，p<0.001），但刺激与破坏组之间无显著交互作用（p=0.23）。各组间在LED刺激或无刺激条件下的跌倒数无显著差异。穿越时间在LED脉冲下减慢，但组间交互作用不显著。
**4. 直旋转杆，连续LED抑制**
连续LED抑制总体增加跌倒（刺激效应p<0.001），且刺激与破坏组交互作用显著（p=0.008）。事后分析显示，仅在双重ACh/DA破坏组中，LED刺激显著增加了跌倒（p<0.001），而仅ACh破坏组和仅DA损伤组中LED刺激对跌倒的影响不显著。穿越时间总体减慢，但组间交互作用不显著。
**4.1. Z形旋转杆，1秒LED抑制脉冲**
在Z形旋转杆上，1秒LED脉冲总体增加跌倒（p<0.001），且刺激与破坏组交互作用显著（p=0.009）。在LED刺激条件下，双重ACh/DA破坏组大鼠的跌倒显著多于仅DA损伤组（p=0.02），但与仅ACh破坏组差异未达显著（p=0.07）。仅在双重破坏组中，LED脉冲显著增加了跌倒（p<0.001）。穿越时间总体减慢，但组间交互作用不显著。
**5. Z形旋转杆，连续LED抑制**
连续LED抑制显著增加跌倒（p=0.001），且刺激与破坏组交互作用显著（p=0.001）。在LED刺激条件下，双重ACh/DA破坏组大鼠的跌倒显著多于仅ACh破坏组（p=0.02）和仅DA损伤组（p=0.003）。仅在双重破坏组中，LED抑制显著增加了跌倒（p<0.001）。穿越时间总体减慢，但组间交互作用不显著。
**6. 信号追踪者与目标追踪者差异**
在所有杆条件下，GT和ST大鼠在跌倒次数上无显著差异，且无交互作用涉及GT/ST。在双重破坏组中，LED抑制对GT和ST的跌倒影响均显著（p<0.01），且无表型差异。
**7. 性别差异**
在直旋转杆上，雌雄大鼠跌倒无显著差异。在Z形旋转杆上，雄性大鼠总体跌倒多于雌性（p=0.02），但LED抑制对双重破坏组中两性均显著增加跌倒（p<0.01）。雄性穿越时间较慢，但性别与破坏组无交互作用。
**8. 组织学分析**
组织学分析显示，抑制性AAV在BF区域（包括nbM、SI、HDB）有广泛表达，且与胆碱能神经元（VAChT阳性）共标。在双重破坏组中，LED诱导的跌倒（净跌倒）与SI和HDB中GFP阳性细胞计数显著正相关（尤其连续抑制下），也与HDB中共标细胞计数正相关。TH评分（反映纹状体DA损伤程度和位置）与双重破坏组在Z形旋转杆连续抑制下的净跌倒显著负相关（r=0.52，p=0.04），即TH损伤越大、越局限在背内侧，LED诱导的跌倒越多。
**总结讨论与结论**
讨论部分指出，本研究证实了选择性光遗传学抑制BF胆碱能神经元，在联合背内侧纹状体DA耗竭时，能诱导出比单独系统破坏更高的跌倒倾向，尤其是在更具挑战性的Z形杆任务上。这与PD患者中常见BF-皮质胆碱能缺陷与高跌倒倾向及认知功能障碍相一致。仅ACh破坏组未表现出显著跌倒增加，验证了双重系统破坏的关键作用。研究认为，PD患者中可能存在对胆碱能-认知资源的依赖来补偿纹状体DA机制缺陷，当BF胆碱能系统也受损时，这些认知资源无法有效补偿，从而暴露出运动控制缺陷，导致跌倒。这种“去掩蔽”效应可能是PD患者跌倒的主要原因，并解释了为什么左旋多巴治疗不能改善跌倒。此外，研究对比了GT和ST表型，发现双重破坏对两者跌倒影响无差异，这与先前仅用化学遗传学抑制BF神经元（非特异性）的研究结果不同，可能由于特异性抑制胆碱能神经元以及光遗传学刺激的快速动态特性。性别差异主要归因于雄性大鼠体型较大，导致在Z形杆上更易跌倒。组织学结果进一步支持了BF胆碱能系统和纹状体DA系统损伤程度与跌倒倾向的相关性。
**研究结论（翻译）**：这些结果共同支持并扩展了先前在大鼠纹状体DA丧失中的发现，即BF向皮层投射的胆碱能神经元破坏会诱发跌倒及相关的步态、平衡和姿势缺陷，与人类PD患者类似。这些效应在具有不同复杂表面穿越认知策略的GT和ST大鼠中均一致观察到。此外，由于光遗传学抑制揭示了BF胆碱能破坏在亚秒时间尺度上对跌倒的影响，因此以这种相位方式增强胆碱能输出的疗法可能有望缓解这些双重系统的运动缺陷，包括认知衰退的症状。
