Tldi1缺陷介导Tlde1自身毒性效应以调控鼠伤寒沙门菌感染的适应性及小鼠宿主免疫应答

《Frontiers in Cellular and Infection Microbiology》：Tldi1 deficiency mediates Tlde1 self-toxic effect to regulate the adaptability of Salmonella Typhimurium infection and host immune response in mice

　　

引言：VI型分泌系统（Type VI secretion system，T6SS）是β-革兰氏阴性菌中一种关键的细菌分泌装置，负责转运效应蛋白以介导细菌与宿主的相互作用。Tldi1是T6SS基因簇中编码的一种已被充分表征的免疫蛋白，可特异性中和同源毒素Tlde1以防止细菌“友军火力”误伤。然而，目前仍缺乏关于Tldi1功能的系统性深入研究。为阐明Tldi1缺陷对鼠伤寒沙门菌（Salmonella Typhimurium）表型及毒性效应的影响，研究人员以鼠伤寒沙门菌SL1344为模型菌株，通过多层次实验探讨了Tldi1毒性对细菌生态适应性及感染过程的调节作用。 方法：首先，研究人员采用分子生物信息学方法分析Tldi1蛋白的理化性质、亲水性、疏水性、跨膜区、亚细胞定位及二级和三级结构。其次，通过同源双交换重组构建鼠伤寒沙门菌tldi1缺陷突变株，并分析其生物学特性的改变。最后，利用小鼠感染模型研究tldi1缺失对鼠伤寒沙门菌感染进程的影响。 结果：结果表明，与野生型（Wild Type，WT）菌株相比，Δtldi1菌株表现出脾脏定植能力下降，并调节宿主炎症反应，而这些表型在Δtldi1/pΔtldi1回补菌株中得到逆转。 讨论：Tldi1作为Tlde1中和的关键免疫蛋白，间接调控鼠伤寒沙门菌的环境适应性和宿主免疫稳态，为T6SS免疫蛋白的功能研究提供了新见解。

该研究发表于《Frontiers in Cellular and Infection Microbiology》。研究背景方面，沙门菌（Salmonella）是重要的革兰氏阴性兼性厌氧杆菌和人畜共患病原体，其中鼠伤寒沙门菌（S. Typhimurium）是食源性暴发的主要血清型之一。其致病性依赖多种毒力决定因子，包括III型分泌系统（Type III secretory system，T3SS）、SPI-1与SPI-2效应蛋白、脂多糖（Lipopolysaccharide，LPS）等，而VI型分泌系统（Type VI secretion system，T6SS）作为接触依赖性分泌装置，通过经典毒素-抗毒素（toxin-antitoxin，TA）模块介导细菌竞争或宿主互作。Tldi1是含有DUF2195结构域的免疫蛋白，可中和效应蛋白Tlde1的毒性，但目前对其在复杂微生物环境中细菌的生存策略、与竞争菌株互作模式及对宿主免疫应答的影响缺乏系统分析，其在鼠伤寒沙门菌感染期间对肠道菌群稳态的具体功能及机制尚未充分阐明，因此开展本研究以探明Tldi1缺失后T6SS免疫蛋白在鼠伤寒沙门菌与宿主肠道菌群互作中的调控作用。

研究人员以鼠伤寒沙门菌SL1344为亲本菌株，构建tldi1基因缺失突变株（Δtldi1）及回补菌株（Δtldi1/pΔtldi1），结合生物信息学分析、体外表型测定与4周龄雌性昆明（Kunming，KM）小鼠感染模型，系统分析突变株与野生型在生长特性、环境胁迫耐受、生物膜形成、运动性、体内毒力、器官定植、宿主炎症因子表达、组织病理及盲肠菌群组成等方面的差异。

主要关键技术方法包括：采用多款计算工具对Tldi1蛋白氨基酸序列及结构特征进行生物信息学预测；通过同源重组双交换技术构建Δtldi1缺失株并利用接合转移与蔗糖反筛选验证，同时构建回补菌株；在普通及添加胆盐的LB培养基中绘制生长曲线并检测酸碱、盐、乙醇、胆盐等环境胁迫下的OD₆₀₀值以评估生长与耐受性；通过结晶紫染色定量检测生物膜形成能力，并在半固体LB琼脂板上测定游泳运动性；选用4周龄SPF级雌性昆明小鼠，设不同菌株感染组与PBS对照组，通过腹腔注射进行小鼠毒力测定并计算LD₅₀，在3 dpi与5 dpi采集肝、脾、盲肠组织测定器官指数、菌落计数（CFU）、进行HE与AB-PAS病理染色，提取总RNA通过实时荧光定量PCR检测IL-12、IL-15、IL-18等炎症因子mRNA表达，收集盲肠内容物进行16S rRNA基因高通量测序分析α与β多样性及菌群组成。

研究结果部分保留原文小标题并总结如下：

3.1 Tldi1的生物信息学分析。研究人员通过亲水性/疏水性分析、TMHMM跨膜预测、SignalP-5.0信号肽预测、DeepLocPro-1.0亚细胞定位、二级与三级结构（AlphaFold-Multimer，pTM=0.74，核心区pLDDT>70）预测，得出Tldi1为138个氨基酸、整体亲水、含第5–27位跨膜区与Sec依赖信号肽、定位于周质空间、含β-桶折叠核心与C端柔性α-螺旋的单次跨膜蛋白。

3.2 SL1344Δtldi1缺失株的构建。研究人员通过PCR与qPCR验证，确认Δtldi1株无tldi1目标片段及mRNA转录，回补株恢复表达，成功构建功能缺失突变与回补菌株。

3.3 tldi1基因缺失改变鼠伤寒沙门菌的环境耐受性。研究人员在普通与含胆盐LB培养基中检测发现，缺失株在正常条件下生长与野生型相似，但在pH=6与8的酸/碱胁迫、递增NaCl浓度、高浓度乙醇、高浓度胆盐胁迫下OD₆₀₀显著受抑（P<0.01），表明Tldi1缺失显著削弱细菌环境胁迫适应能力。

3.4 tldi1基因敲除后鼠伤寒沙门菌的运动性与生物膜形成变化。研究人员通过结晶紫定量与刚果红/考马斯亮蓝染色发现，缺失株在24 h与48 h生物膜形成能力显著降低（P<0.01），添加胆盐后差异消失；游泳运动性在软琼脂上显著减弱，回补株恢复，而胞外基质成分无差异，表明Tldi1影响运动与生物膜但不改变基质组成，胆盐对运动有全局抑制作用。

3.5 tldi1基因敲除后鼠伤寒沙门菌LD₅₀差异。研究人员通过小鼠感染存活曲线发现，野生型LD₅₀为1.8×10⁵ CFU，缺失株为3.2×10⁵ CFU，无统计学显著差异，但在1×10⁶ CFU攻击剂量下野生型14 dpi内100%死亡，缺失株21 dpi仍有存活，提示缺失株毒力衰减；3 dpi与5 dpi肝脾菌落计数无显著差异，但5 dpi缺失株脾脏系数显著降低（P<0.01），说明缺失不改变脏器定植但减轻脾病理反应。

3.6 tldi1基因缺失降低全身炎症细胞因子水平。研究人员通过qPCR检测发现，野生型小鼠脾中IL-18显著上调（P<0.05），肝与盲肠中IL-12与IL-15显著增强（P<0.01），而缺失株相应因子表达显著低于野生型，表明Tldi1缺失削弱Th1相关免疫轴反应。

3.7 tldi1缺陷感染小鼠的器官组织病理学分析。研究人员观察发现，野生型组肝排列紊乱、中央静脉充血、炎细胞浸润，脾窦红细胞积聚与红髓炎症，盲肠绒毛紊乱、杯状细胞增生；缺失株肝、脾、盲肠病变显著减轻，结构接近PBS对照；回补株重现野生型病理，证实表型依赖基因型。

3.8 tldi1基因缺失改变小鼠肠道菌群。研究人员通过16S rRNA测序发现，缺失株感染小鼠盲肠内容物Chao1与observed_features等α多样性指数显著升高（P<0.05），PCoA显示β多样性分离；菌门层面Bacteroidota与Campylobacterota减少、Bacillota增加；属层面Ligilactobacillus、Helicobacter、Lactobacillus、Blautia、Bacteroides、Mediterraneibacter减少，Lachnospiraceae_NK4A136_group与Roseburia增加；LEfSe显示野生型富集c_Bacilli、g_Limosilactobacillus等，缺失株富集g_Lachnospiraceae_NK4A136_group、f_Lachnospiraceae等，表明Tldi1缺失调节菌群多样与结构。

讨论部分总结：研究人员指出T6SS是广泛分布于革兰氏阴性菌的收缩多蛋白复合体，DUF蛋白参与调控与代谢稳态，Tldi1（DUF2195）为T6SS免疫蛋白但其感染中功能不清。本研究通过构建Δtldi1与回补株，发现Tldi1缺失显著损害细菌胁迫适应性、运动性与生物膜形成，且在体外正常生长不变；体内虽LD₅₀无显著差异但生存曲线显示毒力衰减，5 dpi脾萎缩与病理减轻，脾IL-18及肝、盲肠IL-12/IL-15下调，提示损害Th1免疫调节轴；尽管肝脾菌落数无差异，但提出Tldi1可能更影响肠道持久性而非全身扩散，或与其它分泌系统互作，差异可能来自技术与模型变量；菌群分析显示缺失株α多样性升高、Bacteroidota与Campylobacterota下降、特定毛螺菌科富集，减轻菌群破坏；讨论提出T6SS可能通过酶活性、c-di-GMP信号、信号转导三种机制调控运动性，推测Tldi1可能具酶活性或经c-di-GMP间接调控鞭毛，未来需酶学鉴定、电镜观察鞭毛形态与转录组验证；局限在于未构建Δtldi1Δtlde1双缺失株，但基于Tldi1特异中和Tlde1已知关系，表型可能源于Tlde1自身毒性；结论为Tldi1调控鼠伤寒沙门菌环境耐受与运动性，缺失不显著改变总体毒力但减弱实际感染致死与多组织免疫反应，不直接主导肠道定植而可能经调节运动与环境适应促进全身播散与长期感染，是机制研究与减毒疫苗开发的潜在分子靶标。