综述：组织因子与再生医学：塑造基于细胞和细胞外囊泡的治疗方法

《Frontiers in Cell and Developmental Biology》：Tissue factor and regenerative medicine: shaping cell and extracellular vesicle-based therapeutic approaches

　　

再生医学以干细胞技术、无细胞疗法和组织工程的突破为特征，为治疗各种疾病带来了巨大希望。然而，随着转化和临床研究的令人鼓舞的进展，新出现的证据表明，通过血管内输送非天然接触血液的细胞产品，存在发生即时血液介导炎症反应（IBMIRs）和静脉血栓栓塞（VTE）的潜在风险。组织因子（TF），作为外源性凝血级联反应的启动因子，在这些过程中起着关键作用。在这篇综述中，研究人员总结了TF在健康和疾病中的生物学特性和多功能。通过理解其生理和病理作用，研究人员讨论了TF对接受细胞疗法和细胞外囊泡（EV）治疗的患者中IBMIR和VTE的影响。VTE，包括深静脉血栓和肺栓塞，可能具有危及生命的后果。在IBMIR期间，受体的先天免疫细胞和体液凝血因子驱动超急性血栓炎症反应，捕获输注的产品，导致快速的血管内清除和治疗效果受损。此外，研究人员介绍了展示预防和监测TF诱导负面效应的移植方案。鉴于临床研究的日益复杂性和基于细胞的疗法的多样化应用，减轻TF诱导的血栓形成对于更安全、更有效的治疗至关重要。

**2 组织因子蛋白：结构、亚型和表达**
组织因子（TF），又称凝血因子III、组织促凝血酶原激酶或CD142，是一种47 kDa的跨膜糖蛋白，属于2类细胞因子受体家族。其由263个氨基酸组成，分为三个结构域：含有残基1-219的胞外结构域、残基220-242的跨膜结构域和20个氨基酸的短胞质结构域。胞外结构域包含两个免疫球蛋白样结构域，可作为因子VIIa（FVIIa）的受体，启动外源性凝血级联反应。该复合物催化其天然底物因子IX和X的蛋白水解，该过程通过膜中的磷脂激活。TF以三种天然存在的蛋白亚型存在：质膜锚定亚型、可溶性亚型和微囊泡嵌入亚型。全长TF主要作为跨膜蛋白存在于细胞质膜上，是保护身体和器官免受出血的止血屏障的组成部分。TF在血管平滑肌细胞、血管周成纤维细胞和血管壁周围的周细胞中高表达；在脑星形胶质细胞和周细胞、肺上皮细胞、心肌成纤维细胞和心肌细胞、肾小球、黏膜上皮和皮肤角质形成细胞中也有高水平表达。正常情况下，循环血细胞和内皮细胞不显著表达TF，但单核细胞在感染和炎症时可被激活表达，病理状态下内皮细胞也可成为TF的来源。全长TF可整合到微囊泡中，血小板、白细胞、红细胞、内皮细胞和脂肪细胞释放少量TF⁺微囊泡进入血液，且感染、心肌疾病和癌症常进一步增加其血清水平。TF的可变剪接亚型（asTF）缺乏跨膜结构域和与FX相互作用的关键残基，以可溶形式在血液中循环，无凝血活性，直到暴露于磷脂才激活凝血酶形成。asTF约占正常血浆总TF池的30%，其水平在脓毒症、癌症、糖尿病、心血管和肝脏疾病中升高。

**3 TF的功能**
**3.1 凝血**
凝血是保护身体免受损伤和出血的生理过程。在稳态下，内皮细胞分泌多种抗凝因子，包括带负电荷的糖胺聚糖、中性磷脂、血小板抑制剂、凝血抑制剂和纤溶激活剂；血小板处于非活性状态，循环凝血因子保持非活性。当血管受损时，血小板暴露于内皮下组织中的TF、胶原蛋白、血管性血友病因子（vWF）等，被激活并触发凝血级联反应。血小板释放的激动剂和凝血过程中产生的凝血酶放大级联反应并刺激血小板形成更大聚集体。TF在凝血启动和放大阶段均至关重要，主要通过形成TF/FVIIa复合物，该复合物招募并激活FX和FIX，进而产生FXa，FXa将凝血酶原转化为凝血酶，凝血酶将纤维蛋白原裂解为纤维蛋白，并激活FV、FVIII和血小板，纤维蛋白形成稳定凝块封闭损伤部位。

**3.2 信号转导介导细胞存活、增殖、迁移和血管生成**
TF的胞内结构域负责转导信号。表达胞质结构域缺陷TF的小鼠凝血功能正常，但白细胞招募和激活受损，促炎细胞因子（TNF-α、IL-1β、IL-6）水平降低，NFkB和p38信号活性下降。TF的信号转导依赖于TF/FVIIa复合物的蛋白水解活性以及蛋白酶激活受体（PAR）家族。TF/FVIIa复合物以PAR2为底物，而TF/FVIIa/FXa复合物通过内皮细胞蛋白C受体（EPCR）激活PAR1和PAR2。活化的PAR亚基可激活Src家族激酶、MAP激酶级联（如Erk和p38）、PI3K/Akt信号、Rho家族GTP酶等，促进细胞增殖、存活、迁移和细胞骨架重组。TF还通过整合素蛋白家族转导信号：全长TF与β1整合素相互作用，通过Src磷酸化caveolin-1，释放对胰岛素样生长因子1受体（IGF1-R）的抑制，激活IGF1-R并上调细胞周期蛋白D1，降低caspase 3水平，促进细胞存活；asTF直接结合整合素αvβ3和α6β1，分别通过PI3K/Akt和p38 MAPK信号诱导内皮细胞迁移，以及通过PI3K和p40/p42 MAPK通路参与毛细血管形成。TF在胚胎发生和癌症中促进血管生成，其高表达与VEGF水平升高和微血管密度增加相关，并通过激活TF/FVIIa/PAR2信号诱导多种促血管生成因子表达，以及通过RhoA和cortactin调节内皮细胞迁移。

**4 TF对细胞疗法的影响**
**4.1 人多能干细胞疗法**
胚胎干细胞（ESCs）和诱导多能干细胞（iPSCs）在再生医学中具有潜力，但临床研究有限。在已移植的患者中，未报告IBMIR和血栓形成并发症。TF表达数据仍不明确，但研究表明TF在ESC分化过程中上调，例如在滋养层细胞和粒细胞-单核细胞分化中，TF表达与miR-20b下调和ERK1/2信号上调相关。内皮细胞来源的iPSCs表达低水平TF，但TNF-α刺激可显著增强；iPSC来源的血小板比成人来源血小板表达更多TF。因此，尽管ESCs和iPSCs可能表达有限水平的TF，但其分化后代可能上调TF表达，需在临床安全性分析中考虑。

**4.2 人成体干细胞疗法**
间充质干细胞/基质细胞（MSCs）是唯一被报道与血栓形成事件相关的干细胞，其他干细胞也可能构成血栓风险，但数据缺乏。MSCs因其易获取、免疫调节特性、再生功能而被广泛研究，但其血管内输注可引发轻微至严重的血栓栓塞不良事件。MSCs表达可变水平的TF/CD142，且培养可显著增加其表面TF表达，导致IBMIR。TF表面抗原水平不一定与功能促凝血活性相关，因为TF的促血栓性高度依赖其构象状态（从加密转向解密），且细胞产品表面的磷脂酰丝氨酸（PS）可协同加速外源性凝血级联。多种功能性体外凝血检测方法被用于预测细胞治疗产品的血栓风险，包括血栓弹力图（TEG）、旋转血栓弹力图（ROTEM）、荧光底物和发色底物检测、血小板功能测试、全血Chandler环凝血试验等。MSCs的生物学异质性（如组织来源、供体特征、培养条件）影响其TF表达和促凝血风险。例如，脂肪组织来源MSCs（AT-MSCs）和脐带来源MSCs（UC-MSCs）TF表达较高，骨髓来源MSCs（BM-MSCs）基线表达最低；传代次数增加、延长扩增、特定培养基补充物（如动物血清或人血小板裂解物）可上调TF表达。这些差异与体内安全性结果直接相关，如AT-MSCs输注后小鼠存活率低于BM-MSCs。同时，PS暴露也参与凝血，抗TF抗体仅部分抑制MSC诱导的凝血。此外，MSCs在某些条件下可表现出抗凝血作用，可能通过CD73将ATP/ADP转化为腺苷抑制血小板活化。因此，MSCs的促凝血和抗凝血效应可能因实验模型、细胞来源和功能读数而异。

**4.3 非干细胞细胞疗法和实体器官移植**
胰岛移植中，TF在胰岛细胞上表达，激活宿主凝血级联，触发IBMIR，导致血小板结合、白细胞浸润和胰岛完整性破坏。肝细胞移植中，约70%的移植肝细胞因TF表达和IBMIR立即死亡，凝血酶激活补体导致膜攻击复合物形成和细胞裂解。针对这些早期细胞丢失，正在研究系统性抗凝、微囊化和膜结合细胞保护剂等策略。内皮细胞、单核细胞/巨噬细胞和单核细胞来源树突状细胞在炎症或机械刺激下可诱导TF表达，增加血栓风险。在实体器官移植中，肝移植中TF表达升高与急性和慢性排斥反应相关，且TF与纤溶酶原抑制剂-1协同促进早期移植物静脉血栓形成。

**5 TF对基于EV疗法的影响——一个研究不足的问题**
促凝血细胞外囊泡（EVs）由多种细胞在生理和病理条件下分泌。TF⁺ EVs仅占循环EVs的一小部分，但磷脂（如PS）可通过解密过程激活TF，协同加速凝血级联。体液中的EVs（如乳汁、羊水、唾液、尿液）通过TF/FVIIa激活FXa参与止血；骨髓和周围血中约1.3%和0.9%的EVs携带TF。EVs上TF的释放通过PAR2信号调控，内皮细胞在PAR2激活后快速释放高血栓性EVs，随后释放加密TF的EVs。治疗性EV产品的促凝血潜力受上游制造参数和下游加工影响，如分离方法（差速离心、尺寸排阻色谱SEC、切向流过滤TFF）改变蛋白质保留和囊泡群体；与低速离心相比，高速超速离心获得的EV组分凝血活性较低。囊泡类型（大的微囊泡和凋亡小体比纯化的外泌体富集组分具有更高表面PS和全长TF，促凝血性更强）也影响风险。尽管MSC来源EVs在体内毒性试验中显示较低血栓风险，但缺乏高质量临床证据，需建立综合的多参数方法，包括促凝血因子定量和功能跟踪，以及输注后D-二聚体监测。

**6 预防和监测基于细胞和EV疗法的血栓形成**
针对TF表达细胞和EVs诱导的IBMIR和VTE，需实施预防和治疗策略。输注后监测凝血参数，如D-二聚体、凝血酶原时间（PT）、部分凝血活酶时间（PTT）、凝血酶时间（TT）、血小板计数、凝血酶-抗凝血酶复合物（TATc）和纤维蛋白原。肝素（包括普通肝素UFH和低分子肝素LMWH）是最广泛使用的抗凝策略，可与抗凝血酶III结合，抑制凝血酶和FXa，阻断纤维蛋白形成。肝素还可用于细胞培养和制剂的抗凝及抗炎。一些方案使用比伐卢定（凝血酶抑制剂）和利伐沙班（FXa抑制剂）。但不存在通用预防策略，需针对产品特异性参数（组织来源、制造参数、供体变异）、给药途径（血管内 vs. 局部）、患者基础疾病（如COVID-19、心血管疾病、自身免疫病）进行系统性风险-获益评估，同时考虑药物相关并发症（如肝素诱导的血小板减少症HIT和出血风险）。未来指南应聚焦于标准化凝血活性检测、建立稳健的血液相容性评估方案和共识建议。

**7 结论与未来方向**
TF亚型是多功能蛋白，在凝血和细胞调控中起关键作用。在生理条件下与血液不直接接触的多种细胞类型可表达TF，并在刺激后上调。因此，TF及其诱导的血栓活性是再生医学中的关键考量。多种治疗方式（如ESC/iPSC衍生物、MSCs、胰岛细胞、肝细胞及器官移植）可能触发IBMIR和VTE。TF⁺ EVs在体内存在并可被外部刺激上调。提高生物治疗药物安全性需解决TF表达和凝血活性。医疗中心应制定有效的IBMIR和VTE预防和治疗策略，但目前缺乏高质量证据支持抗凝药物的选择、最佳用法及对疗效的影响。未来需开展全面的临床前研究、精心设计的随机临床试验、系统评价和荟萃分析，以评估抗凝药物对安全性和有效性的影响，并制定抗凝类型、剂量、初始给药时间和治疗持续时间的推荐。临床研究应严格监测干预后凝血状况并早期检测血栓事件。