肥厚型心肌病相关Tnnc1变异与小鼠慢骨骼肌的不同肌病改变相关

《Journal of Muscle Research and Cell Motility》：Hypertrophic cardiomyopathy-linked Tnnc1 variants are associated with distinct myopathic changes in slow skeletal muscle of mice

　　

遗传性肥厚型心肌病（HCM）被认为是一种心脏肌节疾病，由存在于编码肌节蛋白基因中的致病变异引起。人类TNNC1基因是一种指定的HCM易感基因，编码肌钙蛋白C（TnC），该蛋白在心脏和I型慢骨骼肌中表达，分别缩写为cTnC和ssTnC。据报道，HCM患者表现出骨骼肌无力和运动耐量下降。携带TNNC1心脏致病变异的患者也在其慢骨骼肌的I型纤维中表达该变异。研究人员假设，I型纤维中TNNC1 HCM变异的存在可能会降低慢骨骼肌的产力能力并改变其抗疲劳性。为了解决这个问题，研究人员在两种HCM敲入小鼠模型A8V+/-、A8V-/-和C84Y+/-及其各自的野生型（WT）对照的比目鱼肌中检验了HCM Tnnc1变异的影响。在高刺激频率下，研究人员发现A8V-/-比目鱼肌的强直收缩力产生低于WT，但在比较这两种变异的疲劳指数时，疲劳方面没有差异。通过比较特定的力百分比（N/cm²）-变异来评估肌肉，发现A8V-/-和C84+/-在低刺激频率下的反应性均增加。纤维类型分析显示，A8V-/-比目鱼肌中I型纤维的丰度增加，但在任一小鼠模型中均未观察到其他纤维类型百分比的差异。比较比目鱼肌中I型纤维的横截面积（CSA）发现，A8V+/+和A8V-/-的平均值较低，而C84Y+/-相对于对照组有所增加。对IIa型纤维CSA的检查发现，A8V+/-和A8V-/-的数值均有所下降，而C84Y+/-比目鱼肌没有变化。对A8V+/-和A8V-/-比目鱼肌的组织学评估揭示了中心核现象，以及通过免疫荧光检测到胚胎肌球蛋白重链，表明存在轻微的再生。相比之下，在C84Y+/-比目鱼肌中未检测到组织病理学变化。研究人员还测量了血清肌因子，以评估致病变异的全身影响和小鼠身体活动的改变，但未发现显著变化。综上所述，研究结果表明，HCM A8V变异改变了比目鱼肌的产力，这可能归因于纤维萎缩和加重的病理生理学变化。

研究背景与问题：肥厚型心肌病（HCM）是一种常见的心肌疾病，可导致心力衰竭和心源性猝死。该病被视为心脏肌节疾病，由编码肌节蛋白的基因（如心肌肌钙蛋白复合体cTn）发生致病变异引起。人类TNNC1基因是HCM的易感基因，编码肌钙蛋白C（TnC），该蛋白在心脏和I型慢骨骼肌中均有表达。既往文献报道，HCM患者常表现出骨骼肌无力和运动耐量下降，但临床上往往只关注心脏症状而忽视了潜在的骨骼肌受累情况。由于TNNC1在心肌和慢骨骼肌中的共享表达特性，心脏中发现的致病变异可能同样在骨骼肌中引发病理改变。然而，HCM相关变异对骨骼肌功能的具体影响目前仍不完全清楚。为了探究这一问题并填补临床认知空白，研究人员开展了此项研究，旨在揭示HCM相关的Tnnc1变异是否会导致慢骨骼肌无力、疲劳及肌病的发生。

研究内容与结论：本研究论文发表在《Journal of Muscle Research and Cell Motility》上。研究人员以携带A8V和C84Y两种HCM相关Tnnc1变异的敲入小鼠为模型，深入探究了这些变异对比目鱼肌功能和结构的影响。研究得出结论，不同的Tnnc1 HCM变异对慢骨骼肌具有截然不同的病理影响：A8V变异会导致比目鱼肌产力下降、纤维萎缩及肌病样改变；而C84Y变异则引发I型纤维肥大且未表现出组织病理学变化。这项研究的重要意义在于，首次在活体动物中提供了直接证据，证明HCM相关的ss/cTnC变异能够影响慢骨骼肌的病理生理学，提示临床在对HCM患者进行诊疗时，需考虑骨骼肌可能存在的并发症及特定变异带来的差异化影响。

关键技术方法：研究人员主要运用了以下关键技术方法开展研究：首先，利用在迈阿密大学和亚利桑那大学生成的Tnnc1敲入小鼠模型（A8V和C84Y杂合及纯合小鼠）的比目鱼肌样本进行离体收缩分析，以测量肌肉在不同刺激频率下的绝对力、特定力及疲劳指数；其次，采用免疫荧光技术对肌肉横截面进行染色，以进行肌纤维类型分析（区分I型、IIa型和IIb型纤维）及横截面积（CSA）测量；再次，运用含有苏木素和油红O染色的组织学评估技术，分析肌肉的脂肪沉积、中心核纤维现象以及胚胎肌球蛋白重链（eMHC）表达情况以评估肌肉再生；最后，采用多重磁珠免疫分析和蛋白质印迹法测定小鼠血清中的肌因子水平及肌肉组织的蛋白表达量。

研究结果：
比目鱼肌表现出特定肌力测量差异：研究人员通过离体肌肉收缩分析发现，在高频刺激（200 Hz）下，A8V-/-比目鱼肌的特定力（N/cm²）显著低于野生型（WT）。在低频刺激（20 Hz）下，A8V+/-和C84Y+/-比目鱼肌的敏感性均增加。然而，在疲劳指数方面，两种变异小鼠均未表现出与WT显著的差异，表明这些变异影响了肌肉的产力能力但不影响其抗疲劳性。

肌纤维类型分析揭示A8V-/-突变体比目鱼肌中I型纤维百分比增加：研究人员通过免疫荧光染色发现，A8V-/-比目鱼肌中I型纤维的丰度显著高于WT，而其他纤维类型百分比无显著差异。由于I型纤维单位横截面积的产力低于其他类型纤维，I型纤维比例的增加可能是导致A8V-/-比目鱼肌整体产力下降的原因之一。C84Y变异小鼠的纤维类型比例则未发生明显改变。

HCM突变导致I型纤维横截面积发生相反改变：研究人员对比目鱼肌中主要的纤维类型（I型和IIa型）的CSA分布进行了测量。结果显示，A8V+/-和A8V-/-比目鱼肌中I型和IIa型纤维的CSA均整体降低，表现出普遍的肌肉萎缩征兆。相反，C84Y+/-比目鱼肌的I型纤维CSA显著大于WT，呈现出I型纤维肥大，而IIa型纤维无明显变化。

HCM A8V小鼠比目鱼肌表现出肌病改变：组织学评估表明，A8V+/-和A8V-/-比目鱼肌中出现了更高比例的中心核纤维，表明存在肌病过程。同时，A8V-/-比目鱼肌中表达了显著高于WT的胚胎肌球蛋白重链，提示该基因型肌肉中存在轻微的再生现象。此外，A8V-/-比目鱼肌中细胞内脂质沉积显著增加，提示其正常的脂肪酸代谢可能受到干扰。而C84Y+/-比目鱼肌则未检测到上述组织病理学变化。

HCM小鼠血清肌因子未观察到差异：研究人员检测了血清中多种与骨骼肌维持相关的肌因子水平。结果显示，尽管不同变异小鼠间某些肌因子表现出趋势上的差异（如BDNF、FGF-21等），但整体而言未发现具有统计学意义的显著改变，表明致病变异对全身系统层面的肌因子分泌影响较为有限。

讨论与结论总结：在讨论部分，研究人员总结了本次研究的发现。A8V-/-变异在比目鱼肌中引起了区别于C84Y+/-变异的独特改变，包括产力下降、纤维萎缩和明显的肌病特征，而C84Y+/-变异则表现出维持正常产力 acompa?ado de I型纤维肥大且无明显组织病变。这表明不同的HCM肌节突变可能通过不同的病理机制影响骨骼肌的适应性，部分变异诱导了足以触发肌纤维损伤和再生的应激反应，而另一些则仅引起代偿性的肥大重塑。研究结论部分明确指出，本研究首次提供了在体（in vivo）证据，证明HCM相关的ss/cTnC变异能够影响慢骨骼肌的病理生理学。具体而言，含有A8V变异的比目鱼肌表现为特定产力下降、I型与IIa型纤维萎缩、中心核增加及再生迹象；而含有C84Y变异的比目鱼肌则保持产力并表现出I型纤维肥大，提示这是一种代偿性的适应性重塑而非进行性退化。本研究支持了这样一种观点：不同的HCM TNNC1变异不仅是同一疾病严重程度的不同表现，而是能够产生具有质变差异的生物力学和代谢状态，并可能在HCM患者中促成相关的骨骼肌病理学改变。