综述：通过多抗原靶向和新型递送方法提高T细胞衔接器在胶质母细胞瘤中的疗效

《Acta Neuropathologica》：Improving T-cell engager efficacy in glioblastoma with multi-antigen targeting and novel delivery approaches

　　

胶质母细胞瘤（GBM）仍然是免疫治疗中难以攻克的疾病，原因是显著的抗原异质性、免疫抑制性肿瘤微环境（TME）以及中枢神经系统（CNS）内有效分子递送的障碍。T细胞衔接器（T-cell engagers）提供了一种现成的方法，将内源性T细胞重新定向至肿瘤细胞。然而，双特异性形式（bispecific formats）受到患者内和患者间抗原异质性的限制，这可能限制治疗效果。在这篇综述中，研究人员审视了三特异性T细胞衔接器（TriTEs）作为一种新兴策略，通过同时靶向多种肿瘤相关抗原（tumor-associated antigens）来解决这一限制。研究人员讨论了指导胶质母细胞瘤（GBM）中抗原选择的原则，总结了支持多特异性接合（multispecific engagement）的现有临床前证据，并概述了关键的设计考虑因素，包括分子架构（molecular architecture）、稳定性（stability）、半衰期延长（half-life extension）和安全性优化（safety optimization）。研究人员进一步回顾了递送策略（delivery strategies），例如基因编码表达（gene-encoded expression）、细胞载体（cellular carriers）和血脑屏障调节（blood–brain barrier modulation），这些策略可能改善TriTEs的肿瘤可及性和持久性。总之，这些考虑将TriTEs定位为一个模块化免疫治疗平台（modular immunotherapy platform），适用于胶质母细胞瘤（GBM）及其他异质性实体瘤（heterogeneous solid tumors）。

胶质母细胞瘤（GBM）是成人中最具侵袭性的原发性脑肿瘤，具有显著的抗原异质性、免疫抑制性肿瘤微环境（TME）和中枢神经系统（CNS）递送障碍。T细胞衔接器（T-cell engager）通过重新定向内源性T细胞至肿瘤细胞，提供现成的免疫治疗策略。双特异性T细胞衔接器（BTE）受限于患者内和患者间的抗原异质性，导致疗效受限。三特异性T细胞衔接器（TriTE）通过同时靶向多种肿瘤相关抗原（TAA）来克服这一限制。

设计TriTE靶向GBM（Designing TriTEs to target GBM）

选择抗原靶点（Selecting antigen targets）：有效设计需平衡肿瘤特异性、生物学相关性和抗体可及性。理想抗原在肿瘤细胞高表达，正常脑组织低表达，且与肿瘤生长、生存或免疫逃逸功能相关。已验证的GBM相关抗原包括白细胞介素-13受体α2（IL13Rα2，60-75%表达，促进侵袭和增殖）、表皮生长因子受体变体III（EGFRvIII，约30%，驱动致癌信号）、表皮生长因子受体（EGFR，约40-60%，促进增殖和耐药性）、人表皮生长因子受体2（HER2，高达80%，但异质性高）和B7-H3（CD276，70-80%，参与免疫逃逸）。BTE靶向这些抗原已提供概念验证，但单抗原靶向导致抗原阴性逃逸，例如HER2靶向后约90%复发，而HER2和EGFRvIII双靶向实现约80%持久清除，为多特异性设计提供依据。此外，非经典抗原如上皮细胞黏附分子（EpCAM）、CD38、黏蛋白家族（MUC1、MUC12、MUC16）、催乳素受体（PRLR）、NKG2D配体（MICA/B、ULBP）和前列腺特异性膜抗原（PSMA）等，可靶向侵袭性亚群或微环境区室。目前仅两种TriTE在GBM模型中评估：DT2035（靶向IL13Rα2和EGFRvIII）在异种移植模型中实现完全肿瘤清除，且长期生存研究中9只小鼠中9只存活至84天，6只存活至122天，而单特异性对照仅部分缓解；另一TriTE（靶向IL13Rα2和EGFR/EGFRvIII）包含纳米抗体和sc(Fc)₂域，在GBM6/GBM39原位移植模型中中位生存期37天，显著优于BTE的29天和对照的28天。当前研究存在局限性，包括在免疫缺陷模型中进行、未监测抗原逃逸等。其他实体瘤的TriTE设计（如EGFR×EpCAM×CD3、EGFR×CD3×CD16）显示增强的效力和持久性，并整合了共刺激域如CD28或检查点阻断如程序性死亡配体1（PD-L1）以恢复T细胞功能，同时结合条件性4-1BB激动或白细胞介素-6受体（IL-6R）靶向以整合免疫激活、逆转耗竭和控制细胞因子风险。

抗体片段和域间连接体的选择（Choice of antibody fragments and inter-domain linkers）：分子架构影响性能。天然抗体包含恒定区（Fc）和两个抗原结合位点，但双特异性构建面临链关联问题。片段化构建如串联单链可变区（scFv）可定制，但缺乏Fc域导致半衰期短。保留Fc域可延长半衰期，如B7-H3/CD3模型保留Fc域后注射后120小时仍有保留，TriTE含Fc域半衰期41小时，但可能增加细胞因子释放综合征（CRS）风险。几乎所有构建使用甘氨酸-丝氨酸（GS）连接体，提供高灵活性和小尺寸以促进血脑屏障（BBB）穿越。22个氨基酸的GS连接体比5个氨基酸的亲和力高8.5倍，小鼠生存期提高63-67%，表明存在最佳长度效应。对于TriTE，CD3片段相对于肿瘤抗原片段的取向重要：Park等发现中心化CD3结合域优化免疫突触几何并最小化脱靶接合；Balyasnikova等将CD3置于第一位置，随后IL13Rα2、Fc域和靶向EGFRvIII的纳米抗体，半衰期41小时，能穿越BBB，并在GBM6和GBM6/39植入小鼠中赋予显著生存获益。不同取向均有效，但需针对独特结合臂定制。

递送考虑（Delivery considerations）

递送面临BBB、血脑肿瘤屏障（BTB）和血脑脊液屏障（BCSFB）三大屏障。BTE（约60 kDa）在全身给药后3小时可在颅内肿瘤快速定位，健康脑组织摄取0.99%±0.41% ID/g，肿瘤2.03%±1.18% ID/g，异质性分布并持续至少24小时，48小时清除。TriTE重组蛋白在全身注射后显示延长血清半衰期和异质性肿瘤内摄取，无需额外增强。增强递送策略包括：放射治疗可破坏BBB，联合替莫唑胺（TMZ）或放疗增强NKG2D配体靶向BTE活性；聚焦超声（FUS）通过微泡暂时开放BBB/BTB，正在临床试验中（NCT07343986）；纳米颗粒封装保护药物并促进穿越；BBB穿梭肽如转铁蛋白受体配体介导转胞吞；局部递送如鞘内给药绕过BBB，减少全身毒性，但需Ommaya储液囊等装置，目前有动物模型重复鞘内递送平台支持；基因编码递送如质粒DNA、mRNA或病毒载体实现原位持续表达，DT2035通过DNA启动表达，包含安全开关；细胞载体如神经干细胞（NSC）分泌IL13Rα2靶向BTE，具有肿瘤趋向性，改善原位GBM患者来源异种移植（PDX）模型生存；嵌合抗原受体T细胞（CAR-T）分泌EGFR靶向BiTE/TEAM分子，实现GBM控制；巨噬细胞可迁移至颅内肿瘤，临床早期经验显示良好安全性；内含肽介导的蛋白反式剪接（PTS）通过两个独立前体肽生成完整T细胞衔接器，减少聚集；Fc或人血清白蛋白（HSA）融合延长半衰期至41-120小时，与新生儿Fc受体（FcRn）结合再循环。每种方法各有优劣，最优策略可能组合使用。

毒性评估（Toxicity evaluation）

需评估CRS和免疫效应细胞相关神经毒性综合征（ICANS）。在免疫活性小鼠GBM模型中，CD3×IL13Rα2 BTE选择性激活肿瘤浸润CD8⁺ T细胞，无外周或脾脏T细胞激活，单细胞RNA测序确认肿瘤限制性效应和常驻记忆T细胞群体扩增，提示抗原依赖性肿瘤限制性接合降低全身毒性风险。设计策略包括逐步给药、血清和脑脊液（CSF）细胞因子实时监测、FcγR沉默突变避免不必要的免疫激活、嵌入共刺激域（CD28、4-1BB）或检查点阻断（PD-L1）促进局部T细胞扩增和细胞因子释放、细胞因子谱分析选择最大细胞毒性和最小脱靶炎症的构建体，如DT2035早期验证。特异性分析应测试对同源抗原（如野生型EGFR）和健康脑组织的反应，确保优先在肿瘤组织中激活T细胞。

结论（Conclusion）

GBM的抗原异质性、免疫抑制性TME和限制性递送障碍限制了大多数免疫疗法效果。通过多抗原靶向和生物技术进展延长生物利用度，T细胞衔接器有望限制抗原逃逸并改善长期肿瘤控制。空间和单细胞转录组学进步可精确识别GBM生态位中抗原共表达，推动生物标志物驱动的患者选择和定制构建设计。与新兴递送方法如PTS或FUS结合，T细胞衔接器可能代表GBM免疫治疗的重要下一步。临床转化需要更精确的患者选择和构建匹配，空间转录组学和液体活检监测可能帮助识别个体肿瘤相关抗原组合并追踪随时间变化。优先步骤包括：GBM抗原共表达图谱、不同TriTE骨架模块（包括Fc沉默、共刺激、检查点阻断和半衰期延长域）的功能评估、逐步给药和血清/CSF细胞因子监测策略、使用定量药代动力学和药效学终点在原位模型中比较BBB穿透递送途径、以及包含纵向抗原丢失和残留疾病监测的临床试验设计。