《Frontiers in Insect Science》：Expression and RNAi characterization of neuropeptides underlying developmental regulation in the Colorado potato beetle
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神经肽是进化上古老的信号分子，通过多种G蛋白偶联受体（GPCR）途径协调昆虫的基本生理和行为过程。尽管它们具有广泛的功能重要性，但单个神经肽的具体作用、受体相互作用及调控机制仍未被充分探索，这限制了研究人员对这些信号系统如何在发育和生理背景下运作的理解。在本研
神经肽是进化上古老的信号分子，通过多种G蛋白偶联受体（GPCR）途径协调昆虫的基本生理和行为过程。尽管它们具有广泛的功能重要性，但单个神经肽的具体作用、受体相互作用及调控机制仍未被充分探索，这限制了研究人员对这些信号系统如何在发育和生理背景下运作的理解。在本研究中，研究人员表征了五种功能多样的神经肽和一种GPCR在马铃薯甲虫（Leptinotarsa decemlineata）组织和生活阶段中的转录表达，随后敲低了糖蛋白激素亚基α2（GPA2）及其同源受体（与糖蛋白激素亚基β5（GPB5）结合，富含亮氨酸重复序列的GPCR 1（LGR1））以进行表型研究。表达分析揭示了神经肽在发育阶段中广泛且组织特异性的变化。通过注射介导的dsRNA敲低GPA2或LGR1后，在死亡率、幼虫体重或取食量方面未检测到显著模式，但在取食试验中，给予LGR1 dsRNA的三龄幼虫体重显著增加，且与对照组相比取食率降低。状态转移模型识别出GPA2和LGR1敲低对发育时序具有显著影响，分别特定于蛹-成虫和幼虫-蛹-成虫的过渡，其中在生活阶段中的时间成为整体生存的关键预测因子。这些发现表明，GPA2-LGR1信号系统在调控马铃薯甲虫的发育进程和稳定生活阶段转换中具有潜在激素作用。
神经肽（neuropeptides）是进化上古老的信号分子，通过多种G蛋白偶联受体（GPCR）途径协调昆虫的基本生理和行为过程。尽管功能广泛，但单个神经肽的具体作用、受体相互作用及调控机制仍未被充分探索，限制了研究人员对信号系统在发育和生理背景下运作的理解。本研究旨在探究马铃薯甲虫（Leptinotarsa decemlineata）中未表征神经肽的功能。研究背景：神经肽主要由中枢神经系统（CNS）的神经分泌细胞和全身内分泌组织产生，通过GPCR发挥作用，调控生长、发育、代谢等关键过程。然而，在多数非模式昆虫中，许多神经肽的功能仍不明确，需要实验方法直接关联基因表达与表型。马铃薯甲虫作为重要农业害虫和RNA干扰（RNAi）敏感模型，为神经肽功能研究提供了理想系统。研究人员开展了以下工作：首先通过qPCR定量分析了五种神经肽（Proctolin、ITP-A、Baratin、Tachykinin、GPA2）和受体LGR1在组织（CNS、中肠、脂肪体）和发育阶段（幼虫、蛹、成虫）的转录表达；随后利用dsRNA饲喂实验敲低GPA2及其受体LGR1，并评估对幼虫生长、取食、生存和发育时序的影响。结论：表达谱显示各神经肽具有组织和阶段特异性模式；GPA2/LGR1敲低主要通过改变发育时序（尤其是蛹-成虫和幼虫-蛹-成虫过渡）影响生理过程，而对体重增长和生存无显著影响。这些发现表明GPA2/LGR1信号系统在调控发育进程和稳定生活阶段转换中具有潜在激素作用。该论文发表在《Frontiers in Insect Science》。
研究人员为开展研究用到以下几个主要关键技术方法：qPCR用于定量神经肽和受体在不同组织（CNS、中肠、脂肪体）和发育阶段（一龄、三龄幼虫、蛹、成虫；样本来自实验室饲养种群，初始种群采集自威斯康星州汉考克农业研究站）的转录表达；dsRNA体外合成并用于饲喂（以马铃薯叶盘为载体）敲低GPA2和LGR1；线性混合模型和beta回归分析体重和取食率；Kaplan-Meier生存分析评估生存差异；Cox比例风险模型和半马尔可夫模型（包含时间-状态效应）分析发育时序的转换风险。
研究结果：
3.1 神经肽基因表达：通过qPCR检测，发现六个基因在幼虫和蛹阶段的相对表达存在差异。Proctolin在蛹雌性中表达最高，幼虫中等；ITP-A在蛹雄性中最高；Baratin在蛹期高于幼虫；Tachykinin在幼虫期低，蛹期升高；GPA2在幼虫期低，蛹期高；LGR1表达范围最广，一龄幼虫中最高，蛹中极低。组织特异性方面，Proctolin、ITP-A、Baratin、GPA2主要在CNS中高表达，Tachykinin在成虫脂肪体和肠中高，LGR1主要在幼虫中肠高表达。
3.2 敲低后幼虫体重：通过线性混合模型分析，三龄幼虫饲喂试验中，低剂量和高剂量LGR1 dsRNA处理组体重增长速率显著高于对照组（+0.0049 g/天，p=0.032；+0.0053 g/天，p=0.020），而GPA2处理组无显著差异。四龄幼虫试验中，各处理组体重增长无显著差异。
3.3 敲低后取食率：通过beta回归分析，三龄幼虫试验中，dsRNA对照组和高剂量LGR1处理组取食率显著降低（p=0.007和p=0.038），低和高剂量GPA2组边缘显著（p=0.06和0.07）。四龄幼虫试验中，所有处理组取食率随时间下降，但无显著处理差异。
3.4 敲低后生存率：通过Kaplan-Meier生存分析，三龄和四龄幼虫试验中，各处理组间生存曲线无显著差异（log-rank p=0.71和0.80）。
3.5 敲低后发育时序：通过半马尔可夫模型分析，三龄幼虫处理中，蛹到成虫过渡（3→4）中，高剂量LGR1和dsRNA对照组显著降低过渡风险（HR=0.023和0.048），高剂量GPA2有类似趋势；蛹到死亡过渡（3→5）中，dsRNA对照、低剂量GPA2和低剂量LGR1显著降低死亡风险。四龄幼虫处理中，幼虫到蛹过渡（1→3）中，高剂量GPA2（HR=7.00，p<0.0001）、低剂量LGR1（HR=3.29，p=0.014）和低剂量LGR1（HR=2.47，p=0.047）显著增加蛹化风险；蛹到成虫过渡（3→4）中，低剂量LGR1显著增加羽化概率（HR=3.1×10?，p=0.0077），高剂量GPA2呈增加趋势（p=0.059）。整体上，GPA2和LGR1敲低一致地改变了后期幼虫和蛹的过渡速率，且该效应在注射和饲喂试验中均出现，表明源于GPA2/LGR1通路干扰。
总结讨论部分：研究人员指出，通过映射神经肽表达谱并结合RNAi功能测试，确定了发育时序是GPA2/LGR1在马铃薯甲虫中影响的主要生理过程，而生长和生存基本不受影响。研究结论：GPA2/LGR1信号系统在调控发育进程和稳定生活阶段转换中具有潜在激素作用，为理解神经肽网络在昆虫内分泌中的复杂性提供了基础，并提示未来可针对其他高表达神经肽（如Agatoxin-like 1、Allatostatin B等）开展功能研究。
