从噬菌体抗性突变体中分离互补噬菌体扩展了对Xanthomonas campestris的控制策略

《Frontiers in Microbiology》：Isolation of a complementary bacteriophage from a phage-resistant mutant expands control strategies against Xanthomonas campestris

　　

细菌对噬菌体的抗性是农业中基于噬菌体的生物防治策略持久使用的主要限制。在这里，研究人员使用野油菜黄单胞菌致病变种（Xanthomonas campestris pv. campestris，Xcc）的一个噬菌体抗性衍生株作为选择性宿主，分离了一个对耐药菌有活性的额外噬菌体。一个自发突变体，命名为Xcc 8004R，在Xcc 8004暴露于噬菌体X1后被分离。Xcc 8004R表现出与野生型菌株相似的生长曲线，但在菌落外观、X1吸附效率和运动表型上不同。全基因组重测序鉴定出编码脂多糖（LPS）核心生物合成蛋白、PilY1、N-乙酰胞壁酰-L-丙氨酸酰胺酶、IS1404转座酶和一个保守假设蛋白的基因中存在突变。使用Xcc 8004R作为分离宿主，研究人员从农业土壤中回收了一个噬菌体vB_Xcc_GYRb1（GYRb1）。GYRb1感染了Xcc 8004和Xcc 8004R，并在两种菌株上表现出不同的吸附动力学。透射电子显微镜显示一个二十面体头部和一个长且不可收缩的尾部。基因组测序揭示了一个环状组装的91,478 bp双链DNA基因组，编码128个预测的开放阅读框和两个tRNA。未检测到可识别的抗生素抗性或细菌毒力基因。系统基因组学、平均核苷酸一致性（ANI）和基因共享网络分析表明，GYRb1与目前可用的相关噬菌体高度差异，可能代表尾状病毒纲（Caudoviricetes）内的一个候选属级谱系。GYRb1在体外抑制了Xcc 8004和Xcc 8004R的生长，并减少了甘蓝叶片中的病害严重度。包含GYRb1和X1的鸡尾酒在体外与单噬菌体处理相比减少了基于OD600的细菌再生长。总之，这些发现支持使用噬菌体抗性细菌突变体作为选择性宿主以获得互补候选噬菌体的可行性，同时强调在实践应用前需要进行受体鉴定、抗性频率分析、溶原性评估和更广泛的宿主范围测试。

论文解读：利用噬菌体抗性突变体分离互补噬菌体以扩展Xanthomonas campestris生物防治策略

**研究背景与问题提出**

黑腐病由野油菜黄单胞菌致病变种（Xanthomonas campestris pv. campestris，Xcc）引起，严重威胁全球十字花科作物生产，可导致高达50%的产量损失。传统防治依赖抗生素和铜制剂，但抗生素过度使用会促进抗菌素耐药性（antimicrobial resistance, AMR）及耐药基因水平转移，而铜制剂在土壤中积累对植物生长和环境产生负面影响。因此，亟需高效、田间适用的替代方案。噬菌体（bacteriophages, phages）因其宿主特异性强、能自我复制、成本低且对有益微生物群落影响小，被认为是控制植物病原菌的有前景的生物制剂。然而，细菌快速进化出噬菌体抗性是阻碍持久生物防治的核心障碍，且抗性突变体在植物体内仍可保持致病性。因此，分离能感染抗性菌群的额外噬菌体对于构建稳健的噬菌体防控策略至关重要。本研究旨在利用噬菌体抗性突变体作为选择性宿主，分离互补噬菌体，以扩展针对Xcc的噬菌体资源。

**研究人员开展的研究与结论**

研究人员首先分离并表征了Xcc 8004的一个自发噬菌体X1抗性突变体Xcc 8004R，然后以该突变体为选择性宿主，从农业土壤中分离到新噬菌体GYRb1。通过基因组、系统发育和功能分析，表明GYRb1能同时感染亲本菌株Xcc 8004和X1抗性衍生株，并在实验室和受控植物试验条件下减少细菌生长和病害严重度。这些发现提供了概念验证证据，证明噬菌体抗性突变体可用作选择性宿主以扩展Xcc生物防治的候选噬菌体资源。该研究发表在《Frontiers in Microbiology》。

**主要关键技术方法**

1. **自发突变体筛选与表征**：通过噬菌体X1与Xcc 8004共培养，筛选抗性克隆Xcc 8004R，并利用点斑实验、生长曲线、吸附效率分析及运动性表型检测进行表征（样本来源：实验室保存菌株Xcc 8004）。
2. **全基因组重测序**：采用Illumina NovaSeq PE150平台对Xcc 8004R进行全基因组重测序，通过BWA-MEM比对和MUMmer工具鉴定单核苷酸多态性（SNP）和插入缺失（indel）变异。
3. **噬菌体分离与纯化**：以Xcc 8004R为宿主，采用双琼脂层法从中国贵州省贵阳市白菜田土壤中分离噬菌体GYRb1。
4. **透射电子显微镜（TEM）观察**：利用2%磷钨酸负染，在200 kV加速电压下观察噬菌体形态。
5. **噬菌体基因组测序与注释**：提取DNA后采用Illumina NovaSeq平台测序，经MEGAHIT de novo组装，GeneMarkS和RAST预测开放阅读框（ORF），BLASTp进行功能注释，tRNAscan-SE预测tRNA，并利用CARD和VFDB筛查抗生素抗性基因（ARG）和毒力因子。
6. **系统发育与比较基因组学分析**：利用Viptree构建蛋白质组树，MEGA基于末端酶大亚基（TerL）氨基酸序列构建最大似然法系统发育树，VIRIDIC计算基因组间平均核苷酸一致性（ANI），vConTACT2进行基因共享网络分析。
7. **体外杀菌实验**：在96孔微板中，于不同MOI下监测OD₆₀₀值，评估单独噬菌体及鸡尾酒（GYRb1+X1）的抑制效果。
8. **体内预防性保护实验**：采用叶面喷施法，在甘蓝京丰一号（Brassica oleracea var. capitata）四至五叶期叶片上预处理噬菌体，24小时后用无菌剪接法接种细菌，14天后测量V形病斑长度。

**研究结果**

**3.1 分离自发噬菌体抗性突变体Xcc 8004R**：通过噬菌体X1与Xcc 8004共培养，获得抗性突变体Xcc 8004R。该突变体在NYG固体培养基上菌落较野生型颜色更浅、光滑湿润不透明，点斑实验确认对X1完全抗性。生长曲线显示Xcc 8004R与野生型生长速率相当。X1对Xcc 8004R的吸附效率（87.64%）显著低于对Xcc 8004（99.17%）。Xcc 8004R的泳动性显著减弱，而群集运动性显著增强。全基因组重测序鉴定出191个序列差异，其中7个位于编码区，包括编码脂多糖（LPS）核心生物合成蛋白、PilY1、N-乙酰胞壁酰-L-丙氨酸酰胺酶、IS1404转座酶和保守假设蛋白的基因突变。以Xcc 8004R为宿主，从土壤中分离到噬菌体GYRb1，其形成直径0.60±0.16 mm的清晰噬菌斑，TEM显示其具有二十面体头部（直径89.2±2.0 nm）和长不可收缩尾部（长度166.8±3.0 nm）。

**3.2 噬菌体GYRb1的宿主范围与稳定性**：点斑实验表明GYRb1能裂解Xcc 8004、Xcc 8004R、Xcc ATCC 33913和X. oryzae pv. oryzae 2212，但对Xcc XC1和X. campestris pv. badrii ATCC 11672无裂解活性。EOP测定确认Xcc 8004为高敏感性（EOP>0.5），Xcc ATCC 33913和X. oryzae pv. oryzae 2212为低敏感性（0.0016 PFU/mL降至1.37×10⁴ PFU/mL。

**3.3 噬菌体GYRb1的最佳MOI与一步生长曲线**：在Xcc 8004中，最佳MOI为0.1和0.01，最终滴度1.69×10⁵ PFU/mL；在Xcc 8004R中，最佳MOI同样为0.1和0.01，最终滴度更高（1.95×10⁶ PFU/mL）。一步生长曲线显示，在Xcc 8004中潜伏期1.5 h，爆发期1.5-2.5 h，裂解量27 PFU/cell；在Xcc 8004R中潜伏期1 h，爆发期1-2.5 h，裂解量80 PFU/cell。

**3.4 体外杀菌活性**：GYRb1在MOI 100和10时对Xcc 8004和Xcc 8004R均表现出更持久的抑制效果。鸡尾酒（GYRb1+X1，1:1，MOI=0.01）处理Xcc 8004后，24 h时OD₆₀₀值低于单独X1处理，且持续至36 h，表明鸡尾酒减少了细菌再生长。

**3.5 基因组特征**：GYRb1基因组为环状双链DNA，长91,478 bp，GC含量66.55%，编码128个ORF和2个tRNA（Arg和Phe）。功能注释将ORF分为结构蛋白（7个）、DNA包装（6个）、DNA复制/修饰（21个）和裂解（2个）四个模块。预测有CI/CII样调节蛋白，但未预测到整合酶，PhageAI预测为烈性噬菌体。未检测到可识别的抗生素抗性基因或毒力因子。

**3.6 吸附动力学**：GYRb1对Xcc 8004R的吸附率高于Xcc 8004。30 min时，对Xcc 8004R的吸附率达91.08%，而对Xcc 8004为77.87%。对Xcc 8004的吸附在15 min后趋于平台，而对Xcc 8004R则持续增加。

**3.7 系统发育分析**：Viptree蛋白组树和TerL系统发育树均显示GYRb1与Acinetobacter噬菌体vB_AbaM_ABMM1（ABMM1）聚为一支，进而与Escherichia噬菌体D6及Punavirus属噬菌体聚为一支，所有噬菌体均属于尾状病毒纲（Caudoviricetes）。

**3.8 比较基因组学分析**：BLASTn显示GYRb1与ABMM1全基因组序列相似性极低，Easyfig比较显示GYRb1编码的128个蛋白中63个（49.22%）与ABMM1有同源性，相似性22%-76%。VIRIDIC分析表明GYRb1与所选系统发育相关噬菌体的基因组间相似性均低于1%，远低于种和属的阈值（95%和70%）。vConTACT2基因共享网络分析显示GYRb1形成单一病毒簇（VC_335_1），仅与15个噬菌体有弱连接，支持其为高度分化的候选属级谱系。

**3.9 体内抗菌活性**：叶面喷施GYRb1预处理24 h后，Xcc 8004和Xcc 8004R接种引起的病斑长度分别减少84.04%和74.07%。鸡尾酒（GYRb1+X1）预处理使Xcc 8004病斑长度减少84.40%，与单用GYRb1效果相当，未观察到拮抗作用。此外，Xcc 8004与Xcc 8004R混合接种的病斑严重度低于单独接种，提示菌株间相互作用，但机制未知。

**讨论与结论**

**讨论总结**：本研究成功分离了X1抗性突变体Xcc 8004R，并以其为选择性宿主获得互补噬菌体GYRb1，证明了该策略的可行性。Xcc 8004R的突变涉及LPS核心生物合成蛋白和PilY1等，可能影响噬菌体吸附，但抗性机制可能还包括吸附后步骤。GYRb1能感染野生型和抗性菌株，且吸附动力学不同，提示其与X1可能使用不同受体。基因组分析表明GYRb1高度分化，可能代表尾状病毒纲内新的属级谱系。GYRb1在体外抑制细菌生长，体内预防性处理显著减少病斑。但需进行受体鉴定、抗性频率分析、溶原性评估（因存在CI/CII样蛋白）和田间稳定性测试，才能推进其实际应用。

**结论翻译**：在本研究中，研究人员分离了Xcc 8004的一个自发X1抗性衍生株，命名为Xcc 8004R。与亲本菌株Xcc 8004相比，Xcc 8004R表现出改变的菌落形态、改变的运动性、降低但仍显著的X1吸附，并在甘蓝叶片中保留了致病性。全基因组重测序鉴定出编码LPS核心生物合成蛋白、PilY1、N-乙酰胞壁酰-L-丙氨酸酰胺酶、IS1404转座酶和保守假设蛋白的基因中存在突变。这些位点是候选抗性相关突变，但其因果作用需要进一步验证。使用Xcc 8004R作为选择性宿主，研究人员从白菜田土壤中分离了噬菌体GYRb1。GYRb1感染了Xcc 8004和Xcc 8004R，在体外抑制了细菌生长，并在受控的预防性甘蓝试验中减少了病斑发展。基因组和系统基因组学分析表明，GYRb1有一个91,478 bp的dsDNA基因组，编码128个预测的ORF和两个tRNA，并且与目前可用的相关噬菌体高度分化，表明它代表了尾状病毒纲（Caudoviricetes）内的一个候选未分类谱系。未检测到可识别的抗生素抗性或细菌毒力基因；然而，CI/CII样调节蛋白需要进一步研究溶原性和安全性。总之，这项工作提供了概念验证证据，表明噬菌体抗性突变体可用作选择性宿主以扩展Xcc生物防治的候选噬菌体资源，同时强调需要受体鉴定、抗性频率分析、更广泛的宿主范围测试、溶原性评估和田间相关功效研究。