猪尾猴妊娠晚期胎儿脑室周围增殖区单细胞转录组图谱

《Frontiers in Neuroscience》：A single-cell transcriptomic atlas of the periventricular proliferative zone in the late gestation fetal brain in the pigtail macaque

　　

背景：胎儿脑在妊娠晚期经历快速的细胞和结构变化，神经发生与胶质发生波塑造皮层回路。脑室区（VZ）、室下区（SVZ）、脑室周围白质（PVWM）和深部白质（DWM）富集神经前体细胞、新生神经元和中间神经元，这些区域在妊娠第三 trimester 人类胎儿脑中难以研究。非人灵长类（NHP）因与人类神经发育轨迹高度相似，提供了克服该局限的转化模型。研究目的是构建猪尾猴（Macaca nemestrina）妊娠晚期胎儿脑脑室周围增殖区的单细胞RNA测序（scRNA-Seq）图谱。方法：研究人员将侧脑室壁、室下区及覆盖白质/灰质样本解离为单细胞，经10X Genomics测序，采用SoupX去除环境RNA、空液滴剔除、双细胞排除，并利用Seurat流程进行整合、无监督聚类和簇注释以构建scRNA-Seq图谱；同时采用scVelo和CellRank2分析发育轨迹。结果：该分析捕获了神经前体细胞、新生神经元、兴奋性与抑制性神经元发育谱系、少突胶质细胞、星形胶质细胞、上皮及血管细胞等多样群体。结论：妊娠第三 trimester 非人灵长类胎儿脑细胞在主要谱系水平与人类胎儿高度相似。该妊娠晚期脑室周围增殖区单细胞图谱为灵长类神经发育关键窗口期的前体、神经元、胶质、血管及免疫细胞状态提供了独特参考，使机制性探究炎症、感染或缺氧损伤如何破坏脆弱神经发生微环境成为可能。

研究背景与立项依据

胎儿脑在妊娠晚期经历神经发生与胶质发生高峰，脑室区（VZ）、室下区（SVZ）、脑室周围白质（PVWM）及深部白质（DWM）构成富集神经前体细胞与新生神经元的神经发生微环境（neurogenic niche），这些区域经脑脊液（CSF）暴露于病原体与炎症因子，对寨卡病毒（ZIKV）、巨细胞病毒（CMV）、缺氧缺血及早产相关免疫激活高度敏感。由于伦理限制，妊娠第三 trimester 人类胎儿脑组织极难获取，既有人类脑单细胞RNA测序（scRNA-Seq）图谱多集中于妊娠15至24周，晚期数据稀缺；非人灵长类（NHP）在妊娠期长度、皮层构筑与神经发生时序上与人高度保守，是理想转化模型，但针对猪尾猴（Macaca nemestrina）妊娠晚期脑室周围增殖区的单细胞图谱此前未见报道。研究人员由此构建该区域高分辨率参考图谱，为后续感染与炎症损伤机制研究提供基线。

主要关键技术方法

研究人员纳入9只健康未感染猪尾猴胎儿（妊娠128.4至158.4天，足月172天），其中4只曾行羊膜腔及绒毛膜蜕膜间隙导管置管并予生理盐水，5只予前臂皮下培养基注射，均剖宫产分娩且无早产并发症，取侧脑室壁、VZ、SVZ、PVWM及DWM进行单细胞解离。测序采用10X Genomics平台，下游分析依次经SoupX校正环境RNA、emptyDrops剔除空液滴、scDblFinder排除双细胞，Seurat v5流程完成SCTransform归一化、Harmony批次校正、UMAP嵌入与无监督聚类（27个簇）；轨迹推断采用velocyto/scVelo计算RNA速率，CellRank2构建VelocityKernel与ConnectivityKernel联合转移矩阵；跨物种比对依托Brain Cell Atlas中人胎脑中脑数据集做Seurat标签迁移；病毒入口受体分析通过文献策展14种神经侵袭病毒受体列表并在簇水平点图展示。

研究结果

研究设计与解剖比对：研究人员展示猪尾猴妊娠144天与人间孕31周冠状切面H&E染色，证实两物种VZ、SVZ、DWM相对位置与皮层灰质标志（扣带回、胼胝体、尾状核、神经节隆起）高度同构，确立解剖可比性。

聚类、注释与细胞来源：质控后保留35,836个高质量细胞，Harmony整合消除导管与培养基两组及性别偏倚，无监督聚类得27个转录迥异群体，手动注释涵盖未分化前体/中间态（UP/I）、pre-OPC、oRG-G、ImmN、IPC、ExN、MGE/CGE谱系、少突胶质谱系、星形胶质谱系、小胶质细胞、BAM、脉络丛、室管膜、血管内皮、周细胞、成纤维细胞等；UP/I居于UMAP中心，辐射出各谱系，pre-OPC与oRG-G呈高MKI67⁺增殖态。

神经元谱系：鉴定IPC（EOMES⁺/TBR1⁺）向深层兴奋性神经元过渡，ExN共表达CUX2/SATB2与残留TBR1，SLC17A6（VGLUT2）阳性；ImmN表达SLC17A6（VGLUT1）/NRGN/CAMK2A呈未成熟态；MGE-IN具LHX6/GAD1/GAD2/CALB2/ST18特征但缺PVALB/SST，CGE前体具PROX1/DLX1/DLX5/RELN弱表达，反映腹侧端脑GABA能前体尚未终末成熟。

少突胶质细胞谱系：pre-OPC（MKI67⁺、NKX2-2弱、PDGFRA⁺）经OPC、COP1/COP2（BCAS1⁺）向OL1/OL2（MOG/PLP1/MBP/MAL⁺）演进，scVelo显示剪切/未剪切RNA比渐进成熟。

星形胶质细胞谱系：oRG-G（EGFR/ASCL1/DLL1/CDK6⁺）向AST0（FABP7⁺）演进，AST0分化为AST+（HIF1A/MT2A/S100A6⁺、MT3下调）、AST1（GLUL/SLC1A2/SLC1A3⁺成熟型）与AST2（GFAP/AQP4/ID3⁺白质/血管周型）；全部AST亚群保留HOPX⁺，符合灵长类层间星形细胞特征。

小胶质细胞：实质小胶质分MG0（稳态，AIF1/CSF1R/TREM2/P2RY12/CX3CR1⁺）与MG1（MRC1/SALL1/MERTK及IL1B/CD86/CLEC12A/ITGAM上调，偏活化态）；边界相关巨噬细胞（BAM）高CD163/LYVE1/MRC1、低SALL1/P2RY12，定位于脉络丛/脑室面。

未分化、基质、血管与上皮细胞：UP/I高核糖体基因；FIB（COL1A2/VIM/DCN/FMOD⁺）、PC（PDGFRB/MYOF/ABCC9/TAGLN⁺）、MPC（VIM/COL1A2/FN1/HMGA2/GREM1⁺）、EC（PECAM1/VWF/CD34/FLT1⁺）、ChP（TTR/CLDN3/4⁺）、Ep（FOXJ1/RFX2/3/DNALI1/CETN2⁺）。

跨物种分析：与Brain Cell Atlas人胎中脑比对，AST0（72%）、AST1（87%）、AST2（83%）、EC（63%）、FIB（91%）、PC（86%）、OPC（99%）、COP1（93%）、OL1（76%）、MG0（63%）、MG1（99%）、BAM（95%）、CGE（70%）、MGE（91%）、MGE-IN（97%）、ExN（98%）、IPC（92%）标签重叠率显示主要谱系跨物种高度保守。

病毒入口受体表达：BAM与MG1共表达WNV（MRC1/MERTK/TIMD4/ITGAV）、VZV（M6PR）、HSV-1/2（HS3ST1）、柯萨奇病毒（CD55）、HIV（CD4）、尼帕病毒（EFNB2）、SARS-CoV（CTSB/NRP1）等多病毒受体；周细胞表达AXL（ZIKV/WNV/CHIKV）、IGF2R（VZV）、ITGB1（CMV）；内皮细胞表达TFRC（JEV）、NECTIN2（HSV-1/2），提示屏障界面细胞系潜在神经侵袭门户。

讨论与结论翻译

该妊娠晚期NHP脑室周围增殖区scRNA-Seq图谱为定义前体、神经元与胶质规范状态提供关键参考，区域对早产、缺氧缺血、机械通气、炎症及先天性感染易感。图谱显示猪尾猴与该区域人胎脑细胞在星形、少突前体、血管、小胶质及神经元谱系转录高度相似；晚期采样富集成熟中神经元与胶质。相较既有人类图谱（多限早孕期、snRNA-Seq或空间转录组）与两个恒河猴早孕期图谱，本资源填补妊娠晚期脑室周围单细分辨率空白。跨物种比对印证主要谱系保守，BAM在人胎数据常缺失而在本图谱完整保留，利于炎症/感染应答建模。ZIKV受体AXL见于周细胞/小胶质/成纤维/星形细胞而pre-OPC不表达，呼应第三 trimester 前体易感性下降假说。局限性在于仅覆盖妊娠晚期第二至第三 trimester 快照、未及早期神经发生波，且聚焦脑室周围未遍览全脑，种间生后轨迹仍有差异，轨迹推断需原位杂交与空间转录组佐证。结论原文意译：妊娠第三 trimester 非人灵长类胎儿脑细胞在主要谱系水平与人类胎儿高度相似；该妊娠晚期脑室周围增殖区单细胞图谱为灵长类神经发育关键窗口期的前体、神经元、胶质、血管及免疫细胞状态提供独特参考，使机制性探究炎症、感染或缺氧损伤如何破坏脆弱神经发生微环境成为可能。论文发表于《Frontiers in Neuroscience》。