《Transboundary and Emerging Diseases》：Innovations, Applications, and Future Trends in Veterinary Diagnostic Technologies
兽医诊断学正经历由技术进步驱动的重大变革，其范围从传统确认特定病原体扩展到对动物群体健康的持续动态监测。这一范式转变有望实现更及时的疾病控制、精准干预以及增强的公共卫生安全。传统的临床和实验室诊断方法，如微生物培养、血清学检测和基于核酸的聚合酶链反应（PCR），构成了当前诊断框架的基石，并根据不同的检测需求和实际环境得到广泛应用。尽管如此，该领域正经历深刻的创新。首先，新型检测技术不断涌现，例如数字PCR（dPCR）、基于CRISPR-Cas的分子诊断工具、下一代测序（NGS）和宏基因组测序。这些技术不仅在灵敏度和特异性上取得了突破，更重要的是，能够实现无偏倚地发现新型病原体。其次，人工智能（AI）与大数据的深度融合正在重塑诊断流程。通过整合和分析来自影像学、基因组学、可穿戴设备以及生产数据等多模态信息流，AI算法能够提供客观、量化的决策支持，促进从症状后诊断向预测性和预防性健康管理的转变。本范围综述系统总结了主流和新兴的兽医诊断技术，阐述并讨论了它们的优势、局限性以及未来发展方向，同时强调多种方法的联合应用是最优诊断策略。
**3. 病原体核酸检测技术**
病原体核酸检测技术具有高灵敏度、高特异性和快速检测的特点，可直接识别病原体遗传物质，突破传统“先培养后鉴定”的局限，在兽医诊断系统中从辅助工具上升为确诊、病原溯源和根除评估的“金标准”。
**3.1. 核心扩增技术**
**3.1.1. PCR技术及其衍生物**：常规PCR和巢式PCR适用于实验室基础病原体定性检测和低载量样本的灵敏检测。实时定量PCR（qPCR）通过荧光染料或探针实时监测扩增过程，依据循环阈值（Ct值）进行定量，是兽医领域应用最广的诊断方法；其中染料法（如SYBR Green）在优化条件下满足临床需求，探针法更适合复杂样本或多重检测。PMA-qPCR结合叠氮溴化丙锭（PMA）染料与qPCR，可区分活菌与死菌。FRET-qPCR通过双探针设计实现超高特异性，适用于单核苷酸多态性（SNP）检测。多重qPCR和高通量多重qPCR可同时检测多个靶标，显著提升筛查效率。Nano-qPCR利用纳米材料革新加热方式，实现极快速度和极高灵敏度。数字PCR（dPCR）代表精准检测前沿，通过绝对定量实现低至10拷贝/μL的检测限，在布鲁氏菌病等疾病中可区分疫苗株与野毒株。
**3.1.2. 等温扩增技术**：重组酶聚合酶扩增（RPA）在37°C–42°C下快速扩增，适合现场即时检测（POCT），如结合侧流试纸条检测非洲猪瘟病毒（ASFV）。交叉引物扩增（CPA）在60°C–65°C下反应45–60分钟，适用于基层实验室。杂交链式反应（HCR）是一种无酶等温扩增技术，在兽医领域仍处于探索阶段，最新PX-HCR技术可进行细胞内实时观察。绝缘式等温PCR（iiPCR）将PCR准确性与等温设备便携性结合，可在40分钟内检测ASFV基因型。PMA-LAMP结合PMA染料与环介导等温扩增（LAMP），仅检测活菌。RHAM通过引入RNase HII酶和探针提高LAMP特异性。核酸序列依赖性扩增（NASBA）专用于RNA高效扩增，可在2小时内检测猪瘟病毒（CSFV）RNA，检测限低至2拷贝/μL。
**3.2. 核酸非扩增检测技术——核酸杂交**
**3.2.1. ISH和FISH**：原位杂交（ISH）和荧光原位杂交（FISH）通过标记探针直接可视化病原体核酸在细胞或组织内的精确定位，提供空间信息和形态学关联。ISH成本低、信号持久，可用于口蹄疫病毒（FMDV）和ASFV的定位。FISH通过多色荧光标记实现多靶标同时检测，适用于多重病原体共定位研究。
**3.2.2. 微阵列芯片技术**：微阵列芯片技术将已知病原体特异性基因探针固定于芯片上，与荧光标记样本核酸杂交，通过读取荧光信号识别病原体。单次运行可检测数千个靶标，适用于高通量筛查、基因分型和宿主-病原体相互作用研究，但定量能力有限。
**3.2.3. 多重连接依赖性探针扩增（MLPA）**：MLPA结合核酸杂交与PCR扩增，通过半探针连接形成完整模板，用通用引物扩增，扩增产物量与拷贝数成正比。可同时检测约40–50个靶位点，适用于拷贝数变异检测和混合感染鉴别，如已成功用于同时检测七种猪呼吸道病原体。
**3.3. 核酸测序技术**
**3.3.1. NGS**：主流下一代测序（NGS）平台包括Illumina SBS、MGI DNBSEQ和Thermo Fisher半导体测序，其中Illumina具有高通量、短读长和高准确度（>99.9%），是动物疾病科研和复杂样本深度测序的首选。NGS可用于抗微生物耐药性基因分析和宿主-病原体相互作用研究。
**3.3.2. 单分子测序**：第三代测序技术如PacBio SMRT和Oxford Nanopore提供超长读长和实时测序能力。PacBio成本较高，主要用于复杂基因组解析和参考基因组构建。Nanopore测序具有便携性和实时性，如MinION可在农场、边境口岸等现场部署，实时监测病毒变异和病原体谱，推动诊断从“假设驱动”向“综合探索与精准定位”模式转变。
**3.4. 多功能技术平台**
**3.4.1. CRISPR-Cas**：CRISPR-Cas技术通过DNA内切酶靶向CRISPR反式报告子（DETECTR）和特异性高灵敏度酶解报告解锁（SHERLOCK）实现单拷贝/μL的检测灵敏度和单碱基分辨能力。DETECTR结合RPA或LAMP，无需精密仪器，已用于ASFV和犬细小病毒（CPV）检测。SHERLOCK用于禽流感病毒（AIV）亚型鉴定。新型Cas12a/Cas13a联合平台可实现“一管双靶”检测。当前局限包括依赖核酸提取、多为定性或半定量、crRNA优化复杂、探针成本高。为克服这些，发展了基于电化学传感器的无探针CRISPR技术、纳米酶比色法以及纳米材料增强信号读出。微流控芯片集成CRISPR-Cas12a可实现20分钟内检测H1N1，数字微流控（DMF）平台MiND-DMF实现全自动“样本进-结果出”，适用于农场和边境现场。
**3.4.2. Argonaute**：Argonaute（Ago）技术具有单碱基分辨率和信号放大能力，常与RPA或LAMP结合用于病原体检测和SNP分型。许多Ago蛋白（如TtAgo）为嗜热型，需高温（65°C–75°C）激活，虽提高了特异性但增加了设备要求。目前缺乏成熟的商业化诊断产品。
**3.4.3. 系统发育分析**：分子系统发育学通过分子时钟校准估算病原体进化速率。Phylowave工具可自动检测基于共享适应度与进化关系的新谱系，量化病原体变异的环境适应能力，识别具有增强传播性或免疫逃逸潜力的新变异，虽尚未直接用于兽医诊断，但具有应用于兽医流行病学的潜力。
**4. 免疫学技术**
**4.1. 免疫酶技术**
**4.1.1. ELISA**：酶联免疫吸附试验（ELISA）是应用最广的免疫酶技术，具有技术成熟、成本低、高通量、易于标准化和自动化的特点。高灵敏度ELISA（如高肽ELISA、化学发光ELISA、纳米信号放大ELISA）提高了检测中和抗体的特异性和灵敏度。超高通量格式包括电化学ELISA、数字ELISA（dELISA）和纳米孔读出ELISA，其中dELISA（如Simoa平台）灵敏度可达传统ELISA的1000倍。纸基ELISA适用于POCT，可结合智能手机拍照定量。液体相ELISA可实现超高多重检测，在兽医诊断中已广泛应用。
**4.1.2. ELISPOT**：酶联免疫斑点试验（ELISPOT）在单细胞水平计数分泌特定细胞因子（如IFN-γ）的细胞，灵敏度可达百万分之一。在布鲁氏菌感染检测中，IFN-γ ELISPOT灵敏度和特异性分别达96.9%和90.6%，比传统血清凝集试验更早检测感染，目前作为特定场景的高级补充工具。
**4.2. 免疫荧光技术**
**4.2.1. 免疫荧光组织化学/细胞化学和FISH**：基于有机荧光染料（如FITC、Alexa Fluor）的免疫组化技术提供靶分子在细胞或组织中的空间分布信息，但操作复杂、需荧光显微镜。FISH基于核酸杂交，可同时检测多个靶标并定位病原体，用于共定位研究。
**4.2.2. 流式细胞术**：流式细胞术是一种高通量、多参数定量分析技术，通过荧光标记抗体识别细胞表面或细胞内抗原，在动物传染病早期诊断中应用日益增多，具有高灵敏度和特异性。
**4.2.3. 荧光免疫层析试纸条**：以量子点（QDs）为标记的免疫层析试纸条可显著提高现场检测灵敏度，如检测H5亚型AIV的灵敏度达0.0625 HAU，特异性100%。
**4.2.4. 时间分辨荧光免疫分析（TRFIA）**：TRFIA利用时间分辨荧光微球实现“零背景”检测，适用于高灵敏度定量检测，如布鲁氏菌抗体检测限达0.048 IU/mL，伪狂犬病毒（PRV）gB抗体检测与ELISA总符合率>95%，并可同时检测犬冠状病毒（CCV）和犬细小病毒2型（CPV-2）。
**4.3. CLIA**
化学发光免疫分析（CLIA）主要包括直接CLIA、酶催化化学发光免疫分析（CLEIA）和电化学发光免疫分析（ECLIA）。磁微粒化学发光技术具有高灵敏度、宽线性范围、快速检测和全自动化能力，适用于大规模筛查和主要动物疾病评估。ECLIA高精度、低背景，但成本较高，已用于H5N1高致病性AIV抗体检测，可检测血清和干血斑样本。智能手机相机化学发光侧流分析已用于ASFV抗体检测，灵敏度比传统胶体金试纸条提高至少两个数量级。
**4.4. 免疫层析技术**
免疫层析技术操作简便、无需仪器、结果直观，适用于基层POCT。第一代胶体金技术成本低，但灵敏度和通量有限。第二代荧光免疫层析技术（如镧系荧光标记）具有低背景和高灵敏度，如铕纳米颗粒免疫层析试纸条用于弓形虫检测。第三代以量子点、上转换纳米颗粒和荧光纳米球为代表，追求超高灵敏度和多靶标同时检测，如量子点微球（QDMs）标记的ASFV抗体检测系统可实现超灵敏定量，双线量子点免疫层析试纸条可同时检测ASFV p54和CD2v抗体，区分高毒力野毒株与弱毒株。
**5. 信号读出与放大技术**
**5.1. 纳米生物传感技术**：基于局部表面等离子体共振（LSPR）、表面增强拉曼散射（SERS）和场效应晶体管（FET）的纳米生物传感技术为兽医诊断提供新方案。SERS技术结合金包覆磁性纳米颗粒的免疫层析试纸条，可实现猪流行性腹泻病毒（PEDV）和猪轮状病毒（PoRV）混合感染的现场鉴别诊断。FET技术通过将PEDV S蛋白单克隆抗体固定于金纳米颗粒（AuNPs）修饰的浮栅碳纳米管FET芯片上，实现实时电信号转换。
**5.2. 直接成像与纳米颗粒计数**：通过物理或光学手段实现单分子或单颗粒级检测的技术（如NanoPick-array、数字p-FLISA、mSATORI）可实现超早期、高精度绝对定量，目前仍处于实验室原型阶段。
**6. 组学技术**
**6.1. 基因组学与宏基因组学**：宏转录组学和宏基因组测序可独立于培养、一次性检测样本中所有微生物，建立病原体“身份证”。全国性研究利用该技术绘制了猪呼吸道疾病“病原体全景图”，精准识别猪繁殖与呼吸综合征病毒（PRRSV）为主要病原。
**6.2. 转录组学**：转录组学动态反映感染过程中基因活性变化，揭示病原体致病策略和宿主免疫应答机制。通过识别不同感染阶段的转录特征，可用于开发新的诊断标志物，如对鸟分枝杆菌副结核亚种（MAP）感染的早期诊断。
**6.3. 蛋白质组学**：蛋白质组学基于质谱或抗体微阵列，比较健康与患病动物样本的蛋白质表达差异，发现诊断生物标志物。如从牛分枝杆菌感染牛血浆的细胞外囊泡中筛选出HSPA8、B2M和HRG三种蛋白作为潜在标志物。基质辅助激光解吸电离飞行时间质谱（MALDI-ToF MS）基于细菌分离培养，可通过微生物蛋白指纹图谱快速鉴定，但依赖纯培养和数据库完整性。
**6.4. 代谢组学**：代谢组学检测小分子代谢物，感染后代谢网络迅速扰动，有利于早期诊断。如肉鸡大肠杆菌败血症研究显示，感染后8小时血清腺嘌呤水平显著下降，可作为早期预警指标。
**6.5. 多组学整合与未来趋势**：当前研究前沿倾向于整合基因组学、转录组学、蛋白质组学和代谢组学，构建“多组学”感染全景图。如通过整合牛冠状病毒（BCoV）感染的转录组和蛋白质组数据，揭示了病毒通过下调补体系统关键组分C3实现免疫逃逸的新机制。
**7. AI与大数据分析技术**
**7.1. 图像识别与分析**：深度学习模型可自动分析医学图像，辅助病变识别和预后判断。如自动分析犬肺癌细胞核形态预测预后，以及数字病理学（DP）通过扫描全切片图像，结合AI算法自动识别病理模式，实现远程诊断和定量分析。
**7.2. 多模态数据融合**：多模态数据融合集成文本、图像和传感器数据，构建综合诊断模型。如基于AI和大语言模型（LLM）的猪胃肠道疾病（PGID）诊断方法，整合文本病例和肠道图像特征，跨模态随机森林分类准确率达87.58%。
**7.3. 宏观组学数据分析**：利用AI分析宏基因组和蛋白质组等组学数据，进行病原体鉴定和功能预测。如YOLO-Cocci模型自动检测鸡球虫卵囊，平均精度（mAP@0.5）达89.6%。DCiPatho深度学习模型通过深度交叉融合，从全基因组序列中准确识别感染动物的病原菌，准确率达95.14%。
**7.4. 智能感知与实时监测**：物联网（IoT）设备与AI算法结合，实现个体和群体健康全天候监测。如AI驱动的热成像系统集成机器人挤奶，自动检测意大利地中海水牛亚临床乳腺炎。猪场中智能轨道巡检机器人和“咳嗽监测器”可收集环境数据和生理指标，通过AI模型评估实现呼吸系统疾病早期预警。
**8. 讨论**
**8.1. 诊断方法选择**：根据世界卫生组织指南，理想检测方法应快速、特异、敏感、无需仪器且成本低。具体选择取决于诊断需求：超灵敏定量选qPCR；现场快速结果选侧流试纸条和等温扩增；未知或复杂病原选NGS；平衡便捷性与准确性选等温扩增-CRISPR组合；实验室大规模样本选ELISA；高灵敏或现场快速诊断选CLIA和荧光免疫层析。区分感染与免疫动物（DIVA）是核心挑战，可通过遗传学、血清学或细胞介导免疫标记实现，需根据疾病特征和疫苗类型选择最优策略。
**8.2. 诊断标准选择**：正确诊断标准是有效动物疾病防控体系的基石。病原体分离鉴定仍是确诊金标准，经典免疫学方法（如凝集试验、病毒中和试验）也作为许多重要疾病的金标准。实际工作中，实时qPCR已成为核心实验室技术，并成为越来越多主要疾病的首选金标准。对于新发病原体，需通过潜在类别模型进行统计验证。
**8.3. AI与大数据驱动的革命**：兽医诊断已从症状后检查转向实时健康监测，从经验依赖转向数据驱动，从通用方案转向精准诊疗。AI可整合多维数据提供客观定量决策支持，并通过宏基因组数据准确识别病原菌。挑战包括数据质量和共享问题、模型“黑箱”性、部署维护成本高以及跨学科人才短缺。未来发展方向强调多模态数据深度融合和联邦学习等隐私保护技术。
**8.4. 多种技术的联合应用**：随着动物疾病复杂性增加，检测方式越来越多地整合不同传感机制，实现多模态传感。如纳米孔测序与实时分析系统结合宿主转录组学、病毒宏基因组学和微生物组分析，实现快速物种级鉴定和实时诊断，成为兽医诊断中的强大颠覆性工具。对于重大动物疾病和人畜共患病，需通过多技术整合提高诊断策略，并借助大数据平台和AI算法加强监测。
