《Journal of Drug Delivery Science and Technology》：Berberine-Loaded Chitosan Nanoparticles Protect Against Radiation-Induced Premature Ovarian Failure Through Modulation of PI3K-PTEN-Akt-FOXO3 Pathway and Autophagy-Inflammasome Signaling
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摘要早发性卵巢功能衰竭是放疗常见的具有临床意义的不良后果，目前尚无有效的生育力保护药物干预手段。其病因在于DNA损伤、氧化应激和炎症作用导致原始卵泡储备耗竭。小檗碱是一种具有强大抗氧化和抗炎作用的天然生物碱，但由于生物利用度较低，其临床应用受到限制。将小檗碱封装在壳聚糖纳米颗粒中
摘要
早发性卵巢功能衰竭是放疗常见的具有临床意义的不良后果，目前尚无有效的生育力保护药物干预手段。其病因在于DNA损伤、氧化应激和炎症作用导致原始卵泡储备耗竭。小檗碱是一种具有强大抗氧化和抗炎作用的天然生物碱，但由于生物利用度较低，其临床应用受到限制。将小檗碱封装在壳聚糖纳米颗粒中，可有效提升其生物利用度和治疗效果。本研究探讨了小檗碱及载有小檗碱的壳聚糖纳米颗粒对大鼠γ射线照射引发的早发性卵巢功能衰竭的保护作用。3.2 Gy γ射线照射后的未成熟斯普拉格-道利雌性大鼠被分为两组，一组接受小檗碱治疗，另一组接受载有小檗碱的壳聚糖纳米颗粒治疗（剂量为10毫克/千克，腹腔注射）。通过组织病理学、免疫组化、生化分析、基因表达检测以及血清FSH、E2和AMH水平测定来评估卵巢保护效果。此外还通过分子对接技术研究小檗碱与HO-1、NLRP3和Nrf2的相互作用。γ射线照射会引发早发性卵巢功能衰竭的典型症状，包括激素紊乱、卵泡减少、氧化应激加剧、颗粒细胞凋亡，以及BAX、PI3K、Akt1和NLRP3基因表达上升，而Bcl2、FOXO3、PTEN和LC3基因表达则下降。载有小檗碱的壳聚糖纳米颗粒治疗显著改善了卵巢功能指标，调节了PI3K-PTEN-Akt-FOXO3信号通路，恢复了LC3介导的自噬作用，并抑制了NLRP3炎性小体的激活。这些结果表明，载有小檗碱的壳聚糖纳米颗粒可通过调节上述信号通路及自噬-炎性小体轴，发挥保护卵巢免受辐射损伤的作用。
引言
电离辐射仍是癌症治疗的基石，在治愈性和姑息性治疗中都发挥着重要作用。然而，这种疗法虽然能带来临床益处，却可能对周围的健康组织造成损害，包括卵巢[1]、[2]。这种损害始于DNA双链断裂的直接形成，随后由于活性氧和活性氮物种过度生成而产生的氧化应激和硝化应激进一步加重了损伤[3]、[4]。由此产生的氧化还原失衡会破坏线粒体功能，激活坏死性、凋亡性和其他死亡途径，这些都是卵母细胞退化的关键机制。同时，促炎因子的持续释放以及炎性小体，尤其是NLRP3的激活，会持续加剧组织损伤[5]、[6]、[7]。基因组损伤、线粒体功能障碍、氧化应激和持续性炎症共同作用，逐渐耗尽原始卵泡储备，最终导致早发性卵巢功能衰竭[8]。
40岁时约有3%的女性会出现早发性卵巢功能衰竭，其临床表现为闭经、雌激素水平下降，以及促性腺激素水平升高，包括卵泡刺激素和黄体生成素[9]、[10]、[11]。在组织层面，该病的发生与颗粒细胞凋亡密切相关，颗粒细胞凋亡是卵母细胞退化之前的早期事件，会直接导致卵泡丢失[8]、[12]。作为卵巢卵泡中的主要体细胞，颗粒细胞通过提供代谢支持、实现细胞间双向通讯以及分泌类固醇激素来维持卵母细胞的发育[13]。因此，颗粒细胞的凋亡会破坏卵泡的结构和功能完整性，加速卵巢储备的耗竭。这一过程可能由多种因素引发，包括激素失调、细胞因子信号传导、氧化应激以及Bcl-2家族调控的凋亡途径的激活[8]。
在分子层面，原始卵泡储备的维持依赖于一个高度调控的细胞内信号通路网络，该网络能够在保持卵泡静息状态的同时，根据生理需求实现可控的激活[14]。这一网络的核心是PI3K-PTEN-Akt-FOXO3信号轴，它负责协调控制原始卵泡的存活、代谢、增殖和分化等分子过程。在该信号轴中，磷酸酶和张力蛋白同源物能够限制Akt的激活，从而防止过多的原始卵泡被招募，维护卵泡的休眠状态[15]。这一调控机制还得到叉头框O3的进一步强化，这是一种由Akt调控的转录因子，能够抑制原始卵泡的过早激活，维持卵泡的休眠状态[16]。一旦PI3K-PTEN-Akt-FOXO3信号轴被破坏，就会加速原始卵泡的招募，进而导致卵巢储备逐渐耗竭，最终引发早发性卵巢功能衰竭[11]、[14]。
与这一信号轴并行，自噬和炎症信号也被认为是维持卵巢稳态的关键因素。微管相关蛋白1轻链3表达异常所反映的自噬功能受损，与颗粒细胞死亡和卵泡退化有关[17]。NLRP3炎性小体的过度激活则会通过促进焦亡性细胞死亡和促炎细胞因子的释放，进一步加剧辐射引起的卵巢损伤[18]、[19]。尽管人们越来越认识到这些不同通路的作用，但PI3K-PTEN-Akt-FOXO3信号通路、自噬作用以及炎性小体激活在辐射诱发早发性卵巢功能衰竭过程中的相互作用机制仍不明确。
鉴于这些致病机制具有多因素特性，因此亟需能够同时针对多个信号通路的治疗策略。在此背景下，小檗碱作为一种天然存在的异喹啉生物碱，因其已知的抗氧化和抗炎作用[20]、[21]，以及作为卵巢保护剂的潜在价值[22]、[23]，而备受关注。小檗碱不仅能通过直接清除活性氧来减轻氧化应激，还能增强体内的抗氧化防御能力，包括谷胱甘肽过氧化物酶、过氧化氢酶和超氧化物歧化酶等酶的功能[24]。这些作用至少部分是通过激活核因子红系2相关因子2和AMP活化蛋白激酶信号通路来实现的[25]、[26]。此外，小檗碱还能通过抑制核因子κB和激活蛋白-1信号通路来抑制炎症反应[27]、[28]。尽管具有这些良好的药理特性，但由于水溶性差、代谢速度快，其全身生物利用度较低，因此临床应用受到限制。将小檗碱封装在壳聚糖纳米颗粒中，可以有效改善其药代动力学特性，提升治疗效果[29]。
不过，目前尚不清楚这些药理优势是否可以通过调节PI3K-PTEN-Akt-FOXO3信号通路、自噬作用以及炎性小体激活，从而起到保护卵巢免受辐射诱发早发性卵巢功能衰竭的作用。考虑到这些信号通路在维持卵泡存活和卵巢稳态中的核心作用，解决这一问题显得尤为重要。因此，本研究探讨了载有小檗碱的壳聚糖纳米颗粒对大鼠γ射线照射引发的早发性卵巢功能衰竭的保护作用，并通过体内实验和计算机模拟相结合的方法，重点分析了PI3K-PTEN-Akt-FOXO3信号轴以及自噬-炎性小体轴的相关机制。
章节要点
材料
壳聚糖（脱乙酰度为93%）和小檗碱均购自美国密苏里州圣路易斯的Sigma-Aldrich公司。五钠三聚磷酸盐和聚乙二醇4000则从印度马哈拉施特拉州的Alpha Chemika公司购买。冰醋酸购自英国英格兰的BDH公司。所有化学试剂均为分析级产品。
实验动物
实验所用未成熟斯普拉格-道利雌性大鼠年龄为3周，体重在35-45克之间，来自曼苏拉大学的动物房。实验开始前，
小檗碱与NLRP3、HO-1以及Keap1-Nrf2复合物的分子对接分析
为了探究小檗碱与辐射诱发卵巢损伤相关的关键分子靶点的相互作用，研究人员对HO-1、NLRP3以及Keap1-Nrf2复合物进行了分子对接分析。结果显示，小檗碱与这三个靶点的结合亲和力较高，且结合模式稳定，其中结合亲和力最高的构象的对接得分详见表2。
在小檗碱与各靶点的结合亲和力中，其与NLRP3的亲和力最高（对接得分为-7.83千卡/摩尔），是因为它能与NLRP3上的Val414位点形成疏水相互作用，
讨论
早发性卵巢功能衰竭带来的影响不仅限于不孕症，还会对心血管系统、神经系统、骨骼系统以及整体健康状况产生不良影响[49]。随着治疗技术的进步，越来越多的年轻女性因放疗而面临长期的生殖问题，这一现象在癌症治疗领域愈发重要[50]、[51]。因此，要想找到保护卵巢储备的策略，不仅需要减轻组织损伤，
结论
本研究结果表明，无论是小檗碱还是载有小檗碱的壳聚糖纳米颗粒，都能在γ射线照射后保护卵巢储备，其中载有小檗碱的壳聚糖纳米颗粒的保护效果更为显著。这类保护作用表现为颗粒细胞增殖增强、AMH分泌恢复、氧化应激水平降低，同时BAX基因表达下降、Bcl2基因表达上升，说明细胞的抗凋亡能力得到提升。此外，本研究还首次证明了小檗碱的卵巢保护作用与PI3K-PTEN-Akt-FOXO3信号通路的调节有关，
作者贡献声明
亨德·埃尔赛德·纳斯尔：论文撰写——审阅与编辑、方法学、实验研究。阿卜杜勒拉赫曼·M·萨利赫：论文撰写——初稿编写、软件应用、方法学、实验研究。雷哈姆·M·阿卜杜勒法塔赫：论文撰写——审阅与编辑、数据可视化、验证、正式分析、数据整理。拉尼娅·E·斯利姆：论文撰写——审阅与编辑、数据可视化、验证、数据整理。海巴·巴尤米：论文撰写——审阅与编辑、数据可视化、验证、软件应用、正式分析、数据整理。海巴·S·优素福：论文撰写——
机构审查委员会声明
本项动物实验方案已获得曼苏拉大学研究伦理委员会的批准，批准编号为MU-ACUC AGR.R.25.08.15。
致谢：
作者们衷心感谢埃及原子能局国家辐射研究技术中心生物化学副教授纳尔明·M·埃尔巴卡里博士，她在实验工作中给予了大力帮助。同时，作者们也感谢佩特拉·罗西克博士对论文的细致审阅以及语言修改方面的协助。此外，作者们还要感谢维也纳大学通过其资助项目对本文开放获取出版的支持，
Amina A. Farag|Mahmoud Mostafa|Yasmen F. Mahran|Heba S. Youssef|Heba Bayoumi|Rania E. Sliem|Reham M. Abdelfatah|Abdulrahman M. Saleh|Hend Elsayed Nasr|Mohammed A. Gebba|Fadwa A. Elroby|Hend S. El-Wakeel|Sahar Soliman
