原发性血小板增多症、前纤维化期骨髓纤维化和显性骨髓纤维化的无创多参数特征分析

《Leukemia》：Non-invasive multiparametric characterization of essential thrombocythemia, premyelofibrosis, and overt myelofibrosis

　　

在骨髓增殖性肿瘤中，前纤维化期骨髓纤维化自2016年世界卫生组织（WHO）分类修订以来，被定义为区别于原发性血小板增多症（ET）和原发性显性骨髓纤维化（PMF）的独立实体，尽管在某些情况下进行精确的特征分析可能较为困难。在此背景下，几种无创参数已显示出区分ET和PMF的潜力。该研究旨在前瞻性评估128名患者（44例ET，53例preMF和21例PMF）的无创参数。从ET到preMF再到PMF，突变图谱变得日益复杂。研究人员观察到，在ET和PMF之间存在炎症介质（IL-1RA，IL-1β，IL-6，S100A8/S100A9，CCL4）、免疫激活标志物（CD25和CXCL10）、基质调节因子（YLK-40和TIMP1）的显著差异表达，以及EGF和CXCL4水平较低，且preMF和PMF之间的结果相似。用于分类患者的两步套索回归策略在内部引导程序验证中可靠地识别了PMF（AUC：0.909 [0.804–0.994]），并在ET和preMF之间实现了合理的区分（AUC：0.762 [0.656–0.847]）。所研究的无创参数能够有效区分PMF，并有助于区分preMF和ET，尽管这些参数较低的辨别力支持了这些疾病之间存在病理生理学连续性的假设。

骨髓增殖性肿瘤（MPN）是一类慢性髓系恶性肿瘤，其特征是驱动基因获得体细胞突变，导致髓系细胞增殖和成熟髓系细胞过度产生。这类疾病，包括原发性血小板增多症（ET）、真性红细胞增多症（PV）和原发性骨髓纤维化（PMF），是一个疾病连续体，因为ET和PV可以发展为继发性骨髓纤维化。前纤维化期骨髓纤维化作为ET和显性PMF之间的中间实体，已被纳入2016年世界卫生组织（WHO）分类修订版。最初在21世纪初被描述为一种有别于ET的组织病理学实体后，Barbui等人随后表明其由于较高的血液学进展风险而预后较差。在2016年和2022年WHO分类中，preMF的诊断组织学标准得到了次要临床生物学标准的补充。然而，在某些情况下，根据WHO分类建立明确诊断仍然具有挑战性。几项研究报告了在骨髓活检（BMB）中区分ET和preMF的困难，专家病理学家之间的共识率为53%-88%。此外，当缺乏preMF的次要标准时，无法做出典型的MPN诊断，导致约10%的病例被归类为不可分类的骨髓增殖性肿瘤（MPN-U）。

目前已经探索了几种无创参数来区分显性骨髓纤维化和ET，包括循环中CD34阳性细胞的定量、血浆细胞因子水平、突变分析和脾脏硬度评估。然而，除了CD34阳性细胞定量外，这些参数尚未在引入preMF的最新WHO分类框架中得到广泛研究。尽管preMF中CD34阳性细胞计数略高于ET，但仅凭这一参数不足以可靠地区分这两种诊断。鉴于此背景，研究人员开展了一项前瞻性研究，旨在评估无创多模态参数在明确定义的ET、preMF和PMF中的辨别潜力，并探讨它们是否有助于无创疾病分类。该研究表明，从ET到preMF再到PMF，疾病呈现出病理生理学的连续性，但PMF仍能被明显区分出来，而preMF和ET在某些生物学特征上存在重叠。该研究发表在《Leukemia》上，其重要意义在于为未来开发用于无创诊断MPN亚型的综合评分系统提供了有价值的潜在生物学标志物框架。

在关键技术与样本队列方法方面，研究人员在法国昂热大学医院和布雷斯特大学医院前瞻性招募了128名新诊断的MPN患者队列。研究主要采用了针对52个髓系基因的下一代测序（NGS）技术进行分子突变图谱分析，并计算变异等位基因频率（VAF）；采用流式细胞术进行循环CD34⁺细胞定量；利用声辐射力脉冲（ARFI）弹性成像技术评估脾脏硬度并测量脾脏大小；通过多重荧光微球技术和酶联免疫吸附测定（ELISA）对包括炎症介质、免疫激活标志物及基质调节因子在内的29种血浆细胞因子进行定量。最后，研究采用多块数据整合框架（DIABLO）和两步最小绝对收缩和选择算子回归模型结合内部引导验证对临床、基因组和细胞因子多层数据进行了综合分析。

患者特征
经过对抽取样本的集中骨髓评估和最终临床生物 adjudication 委员会的确认，研究人员将128名患者分为44例ET、53例preMF和21例PMF。值得注意的是，与初次入院诊断相比，总体重分类率高达40%，preMF比例显著增加。PMF患者多为男性，且脾肿大、贫血、循环红细胞、泪滴细胞及乳酸脱氢酶（LDH）增加的频率更高。在驱动突变中，JAK2^V617F占主导（71%），其次为CALR突变（20%）和MPL^W515突变。

突变图谱
通过NGS分析，研究人员发现JAK2^V617F和CALR驱动突变的VAF从ET到preMF再到PMF呈进行性增加。随着诊断组从ET向PMF推进，突变图谱日益复杂。携带至少一个额外突变的患者比例从ET的34%增加到preMF的57%和PMF的67%。携带2个或更多额外突变的比例在PMF中也显著更高。高风险突变基因（HMR，如ASXL1、IDH1/2、EZH2等）在PMF中比在ET和preMF中更常见，而ET和preMF之间没有显著差异。值得注意的是，preMF患者的DNMT3A突变患病率相对较高，这提示可能存在特定的生物学关联。

循环细胞因子
在量化的29种细胞因子中，研究观察到PMF与ET或preMF相比，炎症介质（IL-1RA、IL-1β、IL-6、S100A8/S100A9、CCL4）、免疫激活标志物（CD25、CXCL10）和基质调节因子（TIMP1、YLK-40）的浓度显著升高。相反，生长因子EGF和血小板衍生趋化因子CXCL4在PMF中显著降低。而在比较ET与preMF时，仅CXCL4显示出显著差异，其在ET中较高。数据表明在MPN表型间存在炎症特征的生物学梯度。

脾脏评估与循环CD34细胞
脾脏大小随疾病严重程度增加，PMF患者显著大于preMF和ET患者。然而，在通过弹性成像评估的脾脏硬度中，根据ET、preMF或PMF诊断未见显著差异。循环CD34⁺细胞浓度在PMF患者中显著高于preMF和ET患者，而在preMF和ET间无显著差异。

参数整合与疾病区分
通过多块数据整合分析，结合临床数据、基因组数据和细胞因子水平，研究人员发现这三个数据块共同允许在第一主成分上清晰区分PMF。对区分PMF贡献最大的参数包括脾脏大小、循环CD34⁺细胞、JAK2^V617F VAF、ASXL1突变等。研究随后应用两步Lasso回归策略进行分类。在第一步区分PMF与非PMF患者时，平均曲线下面积（AUC）达到0.909，具有较高的敏感性和特异性。在第二步非PMF患者中区分ET和preMF时，AUC为0.762。在第二步区分ET与preMF的过程中，需要整合临床、基因组和细胞因子三种数据类型才能获得可接受的区分能力。

讨论部分总结指出，该研究证明了在ET、preMF和PMF中存在一个生物学连续体。尽管如此，PMF仍然可以被清楚地区分为更晚期和具有生物学边界的阶段，其特征在于累积的分子、炎症和血液学异常。尽管所产生的区分能力依旧有限，证实了疾病间连续性假说，但无创参数的整合分析为有效提取PMF信息及辅助区分ET和preMF提供了重要工具。本研究尚存在一定局限性：首先，彻底区分ET和preMF仍然是MPN分类中最具挑战性的问题之一；其次，该模型尚未进行外部验证，尚不能被视作一个可直接应用于临床的评分工具。研究结论部分明确指出，无创多参数研究能够有效区分PMF与ET及preMF，并有助于区分preMF和ET，但这些参数较低的辨别力再次证实了这些疾病状态之间存在病理生理学连续性的假设。