肉毒杆菌神经毒素血清型X蛋白酶进化诱导癌细胞炎性细胞死亡

《Nature Biotechnology》：Evolution of botulinum neurotoxin serotype X proteases to induce inflammatory cell death in cancer cells

　　

触发蛋白酶激活的细胞死亡是一种有前景的癌症治疗策略。在此，研究人员利用噬菌体辅助进化（PACE）重编程肉毒杆菌神经毒素血清型X（BoNT/X）蛋白酶，使其裂解并激活炎性细胞死亡的关键效应因子——procaspase-1和gasdermin D。研究人员还开发了一种高效系统，以广泛表征野生型和进化型BoNT/X蛋白酶变体的底物特异性。进化型蛋白酶在多种癌细胞系中触发了强烈的细胞死亡。其中，裂解gasdermin D的蛋白酶变体专门诱导裂解性死亡，而裂解procaspase-1的变体则同时启动了裂解性和凋亡性细胞死亡。为了实现向哺乳动物细胞的自递送，研究人员将进化型蛋白酶与天然的BoNT易位域（HN）进行重组，从而选择性地杀死培养的癌细胞，同时保留非癌细胞。表达靶向caspase-1的进化型蛋白酶在一个高度耐药的小鼠肿瘤模型中减缓了肿瘤生长。这些发现建立了一个可进化的蛋白酶系统来调控炎性细胞死亡，并凸显了BoNT蛋白酶作为可编程工具用于靶向癌症治疗的潜力。

**论文解读：肉毒杆菌神经毒素血清型X蛋白酶进化诱导癌细胞炎性细胞死亡**

**研究背景、问题与意义**

程序性细胞死亡通路是健康和疾病的重要调节因子。这些通路的失调是支持癌细胞不受控增殖的关键因素。在癌细胞中激活程序性细胞死亡通路，特别是具有高度炎症性和裂解性的细胞死亡形式，如细胞焦亡（pyroptosis），代表了一种有前景的癌症干预手段。细胞焦亡由半胱氨酸蛋白酶caspase-1启动，其在响应病原体或损伤相关信号时通过炎症小体（inflammasome）组装而被激活。激活后的caspase-1裂解底物，如pro-interleukin-1β（pro-IL-1β）、pro-IL-18和gasdermin D。裂解后，gasdermin D形成膜孔，导致细胞裂解和细胞因子释放，从而刺激免疫反应。在肿瘤中诱导细胞焦亡已被证明能促进免疫清除，一些靶向此通路的小分子疗法已被批准作为化疗药物。另一种替代策略是递送重编程的蛋白酶，催化裂解并激活细胞焦亡的关键蛋白介质，包括caspase-1和gasdermin D，以模拟天然炎症信号。肉毒杆菌神经毒素（BoNT）蛋白酶因其催化机制、模块化结构、自递送能力及已证实的可进化性，成为此类策略的理想起点。然而，尽管BoNT具有这些优势，但此前尚未有研究将BoNT蛋白酶工程化，使其直接诱导细胞状态的改变，例如诱导裂解性细胞死亡。本研究旨在通过噬菌体辅助连续进化（PACE）技术，进化BoNT/X蛋白酶，使其裂解并激活procaspase-1或gasdermin D，从而在癌细胞中诱导炎性细胞死亡，并探索其在癌症治疗中的潜力。该研究论文发表在《自然·生物技术》（*Nature Biotechnology*）上。

**主要关键技术方法**

研究人员为解决上述问题，采用了一系列关键技术方法。首先，使用噬菌体辅助连续进化（PACE）及其衍生技术噬菌体辅助非连续进化（PANCE）来重编程BoNT/X蛋白酶的特异性，使其能裂解procaspase-1或gasdermin D的底物序列。其次，开发了一种基于细菌的蛋白酶底物谱分析方法，通过将PACE的遗传回路改造为抗生素抗性基因筛选系统，实现对蛋白酶在数千种底物上裂解活性的高通量并行表征。此外，利用串联质量标签-末端胺同位素标记（TMT-TAILs）技术，对进化型蛋白酶的脱靶底物进行全局谱分析。最后，在KPCY 6419c5小鼠胰腺导管腺癌细胞系（来源于KPC小鼠模型）中评估了体内抗肿瘤效果。

**研究结果**

1. **应用PACE回路进行蛋白酶进化**：研究人员构建了一个双选择的PACE回路，通过正选择（促进所需底物裂解）和负选择（抑制非目标底物裂解）同时进行，来进化蛋白酶，从而将噬菌体增殖与蛋白酶活性偶联，并筛选出能裂解细胞死亡效应因子的蛋白酶。

2. **进化procaspase-1裂解蛋白酶**：通过分步使用PANCE和PACE，并逐步增加底物序列与procaspase-1的相似性及选择压力，研究人员成功将BoNT/X蛋白酶重编程为X(PC)，使它能特异性裂解procaspase-1，同时完全丧失对其天然底物VAMP1的活性。通过后续针对IL-1β的负选择，进一步获得了脱靶活性更低的X(PC5)变体。

3. **天然和进化型蛋白酶的底物特异性谱分析**：研究人员开发的高通量底物谱分析表明，与野生型BoNT/X相比，X(PC)对底物序列的要求更为严格，在P3到P3'位点显示出高度特异性。该分析还预测了包括claspin（CLSPN）、catenin β-1（CTNB1）等多种潜在脱靶底物，其中一些在细胞存活过程中发挥关键作用，表明X(PC)可能通过裂解这些蛋白来启动复杂的多通路细胞死亡。

4. **用串联质量标签-末端胺同位素标记（TMT-TAILs）进行neo-N端全局谱分析**：通过TMT-TAILs技术，研究人员在HEK293T细胞中鉴定出peroxiredoxin-4（PRDX4）等九个潜在脱靶底物。在SUP-B15细胞中，鉴定出tubulin α-1B chain等底物。这些结果证实X(PC)能裂解内源性caspase靶点，提示其诱导的细胞死亡可能涉及凋亡和炎症通路。

5. **进化gasdermin D裂解蛋白酶**：通过类似的分步进化策略，并结合底物长度优化、负选择及通过引入突变（如Glu72Arg和Glu113Lys）进行工程化改造，研究人员最终获得了能有效裂解gasdermin D的X(GD)蛋白酶。

6. **癌细胞系中的细胞死亡**：在稳定表达X(PC)的THP-1细胞中，X(PC)同时触发了凋亡和裂解性细胞死亡，这种混合表型具有PANoptosis的特征。而X(GD)则仅在THP-1细胞中诱导了裂解性细胞死亡。在SUP-B15细胞中，X(PC)主要通过激活caspase-1诱导典型的细胞焦亡，X(GD)也诱导了裂解性死亡。

7. **进化型蛋白酶向癌细胞的自递送**：将X(PC)或X(GD)与BoNT/X的易位域（HN）融合并纯化，形成的嵌合蛋白能有效进入SUP-B15细胞并诱导细胞死亡，但对HEK293T细胞无毒性，显示出细胞类型选择性。通过PRISM平台对475种癌细胞系进行筛选，识别出20种对X(PC)敏感的细胞系，其中caspase-1的表达水平是预测敏感性的关键生物标志物。

8. **X(PC)在体外和体内杀死耐药KPCY肿瘤细胞**：在高度耐药的KPCY 6419c5小鼠胰腺导管腺癌细胞中，诱导X(PC)表达能有效诱导裂解性细胞死亡。在异种移植小鼠模型中，通过给予doxycycline诱导X(PC)表达，可显著抑制肿瘤生长，其效果优于该模型所耐受的联合化疗免疫治疗方案。

**讨论与结论**

讨论部分指出，本研究建立了一个通用的可进化蛋白酶系统，利用BoNT/X蛋白酶和PACE技术，成功重编程了蛋白酶特异性，使其能够裂解具有细胞命运功能性后果的靶标。进化出的X(PC)和X(GD)蛋白酶表现出不同的细胞死亡表型和动力学特征，表明针对不同靶标的进化型蛋白酶能驱动不同的结果。研究还开发了底物兼容性谱分析系统，有助于理解工程化蛋白酶的特异性。

研究结论部分可以翻译为：总之，我们的研究结果建立了一个通用的策略，用于进化出能裂解非天然、治疗相关靶标并重编程细胞行为的蛋白酶。通过利用细胞死亡作为模型系统，我们证明了工程化蛋白酶可以作为定制化的细胞命运效应器，为可编程的催化生物治疗提供了基础。