《Journal of Diabetes Research》：CD36 Regulates PANoptosis in Diabetic Retinopathy via the NOTCH/MAML Pathway
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在全球范围内，糖尿病视网膜病变（diabetic retinopathy, DR）是导致视力丧失的主要原因。然而，PANoptosis（一种结合了凋亡、焦亡和坏死性凋亡特征的炎症性细胞死亡形式）在DR发展中的作用尚未完全阐明。本研究探讨了高糖（high glu
在全球范围内，糖尿病视网膜病变（diabetic retinopathy, DR）是导致视力丧失的主要原因。然而，PANoptosis（一种结合了凋亡、焦亡和坏死性凋亡特征的炎症性细胞死亡形式）在DR发展中的作用尚未完全阐明。本研究探讨了高糖（high glucose, HG）诱导的人视网膜微血管内皮细胞（human retinal microvascular endothelial cells, hRMECs）中PANoptosis的分子机制，重点关注清道夫受体CD36和NOTCH/MAML信号通路。HG特异性地诱导hRMECs中的PANoptosis，表现为凋亡、焦亡和坏死性凋亡标志物的同时激活，以及PANoptosome复合物的形成和通过末端脱氧核苷酸转移酶dUTP缺口末端标记（terminal deoxynucleotidyl transferase dUTP nick end labeling, TUNEL）染色进行的形态学验证。HG显著上调CD36表达并激活NOTCH/MAML通路。CD36过表达通过增强细胞死亡、炎症反应和氧化应激加剧了PANoptosis，而CD36敲低则提供了保护。机制上，CD36通过激活NOTCH/MAML通路促进PANoptosome组装，表现为NICD-MAML1核共定位增加和NOTCH组分表达增强。研究人员进一步验证了CD36-NOTCH轴通过调控NLRP3（一种PANoptosome的核心组分）来调节PANoptosis。使用DAPT进行的药物性NOTCH抑制改善了HG诱导的PANoptosis，而NOTCH激活则模拟了CD36过表达的效应。这些结果在糖尿病视网膜内皮细胞中建立了一个新的CD36-NOTCH/MAML-NLRP3-PANoptosis调控通路。这一发现为DR发病机制提供了重要见解，并指出了治疗干预的潜在靶点。
**研究背景与问题**
糖尿病视网膜病变（diabetic retinopathy, DR）是全球工作年龄人口可预防性失明的主要原因，其发病率随糖尿病大流行而上升，影响超过5亿人。当前治疗（如激光光凝和抗VEGF药物）针对晚期疾病且疗效有限，亟需揭示早期DR分子通路。DR病理生理学由慢性高血糖驱动，引发氧化应激、炎症和代谢重编程，导致视网膜细胞（包括视网膜色素上皮细胞、内皮细胞和周细胞）功能障碍和死亡，破坏血-视网膜屏障。PANoptosis是一种新型炎症性程序性细胞死亡，整合了焦亡、凋亡和坏死性凋亡，由PANoptosome复合物驱动。已有研究证实PANoptosis样细胞死亡存在于视网膜神经元缺血/再灌注损伤和脑缺血中，提示其在中枢神经系统疾病中的关键作用。尽管PANoptosis已被牵涉于糖尿病肾病和心肌病中，但其在DR中的作用尚未探索。CD36作为B类清道夫受体家族的跨膜糖蛋白，参与脂肪酸转运、内皮调节、炎症、氧化应激和凋亡。在糖尿病视网膜中，CD36上调促进脂质沉积、活性氧（reactive oxygen species, ROS）产生和炎症细胞因子分泌，诱导凋亡和血管屏障破坏。近期机器学习分析已将CD36鉴定为DR相关PANoptosis的潜在核心基因，但其精确信号作用仍不清楚。此外，CD36可通过促进无菌炎症中可溶性配体的细胞内成核来协调NLRP3炎症小体激活，使其成为炎症小体激活的中心调节因子。NOTCH作为高度保守的信号通路，协调关键细胞命运决定，其下游Mastermind-like（MAML）蛋白是Notch细胞内结构域（Notch intracellular domain, NICD）依赖性转录的关键共激活因子。糖尿病视网膜中NOTCH通路失调与炎症和血管功能障碍相关，例如NOTCH1信号异常激活可诱导病理性血管通透性（糖尿病黄斑水肿的标志）。然而，上游受体CD36是否与下游PANoptosis执行之间存在直接信号轴，以及NOTCH通路是否参与桥接这一缺口，仍是一个重要未解问题。
**研究内容与结论**
基于此背景，本研究探讨了潜在的“CD36-NOTCH/MAML-NLRP3-PANoptosis”调控轴。利用体外高糖（high glucose, HG）诱导的视网膜细胞模型，结合分子和细胞病理学技术，研究人员表征了DR视网膜PANoptosis过程中CD36表达变化，验证了其对关键NOTCH/MAML通路分子的调控作用，并阐明了该通路介导视网膜PANoptosis的具体机制。研究结果建立了糖尿病视网膜内皮细胞中CD36-NOTCH/MAML-NLRP3-PANoptosis调控通路，为DR发病机制提供了新见解，并指出了治疗干预的潜在靶点。论文发表在《Journal of Diabetes Research》。
**主要关键技术方法**
研究使用人视网膜微血管内皮细胞（human retinal microvascular endothelial cells, hRMECs，来源：Procell Biotechnology，中国）。主要技术包括：细胞培养（正常糖/高糖/渗透压对照处理），基因过表达（pcDNA3.1-CD36质粒转染）和敲低（siRNA靶向CD36），NOTCH通路调节（Jagged1肽激动剂和DAPT抑制剂），细胞活力检测（CCK-8法），凋亡分析（Annexin V-FITC/PI流式细胞术），TUNEL染色，ELISA检测炎症因子（IL-1β、IL-18、TNF-α、IL-6），ROS检测（DCFH-DA探针），Caspase-3/7活性测定，qPCR，Western blot，免疫荧光（IF）和免疫共沉淀（Co-IP）。统计采用单因素方差分析（ANOVA）和Tukey事后检验。
**研究结果**
3.1. HG诱导视网膜细胞活力下降和PANoptosis特征性激活
通过CCK-8和流式细胞术发现，高糖（HG）组细胞活力显著降低，凋亡率升高，Caspase-3/7活性增加。Western blot显示HG组凋亡标志物（cleaved Caspase-3、Bax）上调，抗凋亡蛋白Bcl-2下调；焦亡标志物GSDMD-N升高，伴IL-1β和IL-18分泌增加；坏死性凋亡标志物RIPK1、RIPK3和p-MLKL上调。TUNEL染色证实HG组DNA断裂增加。IF和Co-IP进一步显示HG促进PANoptosome组分（ASC、Caspase-1、NLRP3、RIPK3）的相互作用和斑点形成，证明HG诱导了PANoptosis。
3.2. HG上调CD36表达并激活NOTCH/MAML信号通路
IF、qPCR和Western blot显示HG组CD36表达和膜定位显著增加，同时NOTCH通路核心组分（Notch1/2/3、MAML1/2/3）和NICD表达上调，NICD-MAML1核共定位增强。HG还导致ROS水平升高及炎症因子IL-6、TNF-α分泌增加。
3.3. CD36调控HG诱导的PANoptosis
通过CD36过表达和敲低实验，CCK-8和流式细胞术显示CD36过表达进一步降低细胞活力、增加凋亡率，而敲低则保护细胞。Western blot显示CD36过表达增强凋亡、焦亡和坏死性凋亡标志物，敲低则抑制。IF证实CD36过表达增强p-MLKL膜转位。ELISA显示CD36过表达增加IL-1β和IL-18分泌，敲低则减少。Western blot还显示CD36敲低降低NLRP3表达，表明CD36通过调控NLRP3参与PANoptosis。
3.4. CD36通过NOTCH/MAML通路介导PANoptosis
IF和Co-IP显示CD36过表达增强PANoptosome组装（ASC和Caspase-1斑点增加及组分间相互作用），敲低则抑制。CD36过表达增强NICD-MAML1核共定位，上调NOTCH通路蛋白（Notch1/2/3、NICD、MAML1/2/3），敲低则相反。CD36过表达还加剧ROS和IL-6、TNF-α产生，敲低则减轻。这些结果证实CD36通过NOTCH/MAML通路促进PANoptosome组装。
3.5. NOTCH通路抑制改善HG诱导的PANoptosis
用NOTCH激动剂（Jagged1肽）或抑制剂（DAPT）处理细胞。激动剂进一步降低细胞活力、增加凋亡率、Caspase-3/7活性、炎症因子分泌和ROS水平，模拟CD36过表达效应。抑制剂DAPT则改善细胞损伤，抑制凋亡、焦亡和坏死性凋亡标志物，恢复Bcl-2表达，减少PANoptosome组分相互作用和p-MLKL膜转位，并下调NOTCH通路蛋白表达。这些结果确认NOTCH/MAML通路是CD36介导PANoptosis的关键下游效应器。
**讨论与结论**
讨论部分强调，本研究首次证明HG在hRMECs中诱导PANoptosis，并阐明CD36通过激活NOTCH/MAML信号通路，驱动PANoptosome组装和细胞死亡。CD36作为关键上游调节因子，其敲低可保护细胞。NOTCH通路抑制剂DAPT可缓解PANoptosis，提示其治疗潜力。研究建立了CD36-NOTCH-NLRP3-PANoptosis轴，为DR治疗提供了新策略。结论部分翻译如下：总之，本研究描绘了DR发病机制中一个先前未表征的通路：HG上调CD36，进而激活NOTCH/MAML信号级联，最终导致NLRP3依赖性PANoptosome组装和视网膜内皮细胞PANoptosis的执行。这一事件级联推动了血管细胞丢失和炎症，促进DR进展。尽管本研究提供了全面的体外分析，但有必要在DR体内动物模型中进一步验证。未来研究还应鉴定涉及的特定CD36配体，并探索与其他信号通路的潜在串扰。尽管如此，研究结果突出了CD36-NOTCH-NLRP3-PANoptosis轴，为治疗DR提供了有前景的新策略，并可能预防或延缓这一破坏性疾病进展。
