白色脂肪细胞对较低温度的适应：对能量代谢和蛋白质乙酰化的影响

《The FASEB Journal》：Adaptation of White Adipocytes to Cooler Temperatures: Impacts on Energy Metabolism and Protein Acetylation

　　

全身各处的脂肪细胞处于不同的热环境中。体内核心部位的脏脂肪细胞维持在37^oC附近，而骨髓、皮下和真皮脂肪库中的脂肪细胞则占据外周壳层中较冷的区域。尽管棕色脂肪细胞和米色脂肪细胞对冷应激的反应已被充分表征，但对于白色脂肪细胞如何适应低于37^oC的中等程度降温，了解甚少。研究人员近期的工作揭示，暴露于31^oC（代表远端脂肪区域的温度）的培养脂肪细胞表现出增强的线粒体功能，包括增加的底物氧化和ATP周转，但这一上调的机制尚不清楚。在此，研究人员显示，对低温的适应导致未分化和分化脂肪细胞中蛋白质乙酰化广泛降低，且与营养状态无关，并且这种变化在复温后易于逆转。亚细胞分级分离和免疫印迹表明，低乙酰化与线粒体内乙酰化蛋白的区室特异性富集同时发生，指示线粒体乙酰组的定向重塑。转录组和生化分析揭示，这些温度依赖性变化的发生不伴有乙酰转移酶或去乙酰化酶表达、NAD⁺浓度或乙酰辅酶A可用性的改变，提示通过影响乙酰辅酶A通量或酶活性的替代机制进行调控。整合的乙酰化蛋白质组和代谢组学分析鉴定了线粒体酶，包括丝氨酸羟甲基转移酶2（SHMT2）和丙酰辅酶A羧化酶α（PCCA），其乙酰化水平与相关代谢物池的变化密切相关。总之，这些发现确立了生理相关冷却作为脂肪细胞中线粒体蛋白质乙酰化和代谢适应的细胞自主调节因子。

**论文解读：白色脂肪细胞对低温适应的分子机制——能量代谢与蛋白质乙酰化的重塑**

**研究背景与问题**

温度是影响细胞生物学功能的基础环境因素，但在恒温动物中，不同组织间存在显著的温度异质性。例如，内脏脂肪细胞位于体核附近，温度接近37^oC，而皮下、真皮和骨髓中的脂肪细胞则处于外周壳层，温度通常低于体核。这种空间温度梯度提示，同一细胞类型可能根据其热生态位采取不同的代谢和信号状态。已有研究表明，在体外将脂肪细胞培养于31^oC（模拟远端脂肪组织温度）可诱导其代谢程序重编程，包括增强线粒体呼吸能力、增加脂质周转以及改变底物偏好（更多依赖丙酮酸、谷氨酰胺和脂肪酸，而非葡萄糖）。然而，这种温和降温如何驱动线粒体功能的显著变化，其分子机制尚不明确。蛋白质赖氨酸乙酰化是一种连接代谢与酶功能、细胞器活性和基因调控的翻译后修饰。由于乙酰化依赖于乙酰辅酶A（acetyl-CoA）的可用性、氧化还原状态和去乙酰化酶活性，它可能作为整合环境信号（包括温度）与代谢输出的一类传感器-效应器系统。但生理相关的“冷”温度如何影响全局乙酰化景观，以及特定线粒体酶的温度依赖性乙酰化是否参与脂肪细胞代谢重塑，此前尚未被系统研究。

**研究目的与结论**

研究人员假设温度依赖的蛋白质乙酰化变化可能参与线粒体功能的上调。通过培养的脂肪细胞，研究人员系统分析了从37^oC转移到31^oC后全局及区室特异性蛋白质乙酰化的变化，并探究了经典乙酰化调控因子（赖氨酸乙酰转移酶KATs、去乙酰化酶KDACs、乙酰辅酶A代谢）的作用。通过整合乙酰化蛋白质组学与靶向代谢组学，研究人员鉴定了候选酶，如丝氨酸羟甲基转移酶2（SHMT2）和丙酰辅酶A羧化酶α（PCCA），其乙酰化状态与相关代谢物池的变化相关联。主要结论是：生理相关冷却（31^oC）作为细胞自主调节因子，引起脂肪细胞广泛的蛋白质乙酰化降低（尤其是线粒体），这种变化独立于营养状态且可逆，不依赖于经典乙酰化酶/去乙酰化酶的表达或辅助因子水平，而是通过影响乙酰辅酶A通量或酶活性的替代机制实现。该研究发表于《The FASEB Journal》。

**主要技术方法**

1. **动物模型与细胞来源**：C57BL/6J雄性小鼠（来自Jackson Laboratory）分别饲养于22^oC或30^oC 12周，用于离体呼吸测量实验。细胞实验使用从小鼠耳部分离的间充质干细胞（MSCs）以及从ZenBio购买的人皮下基质血管细胞（SVCs）分化为脂肪细胞。此外，还使用了乳腺癌细胞系MCF7、MDA-MB-231和BT-474（来自ATCC）。

2. **亚细胞分离与蛋白质检测**：采用NE-PER试剂盒进行核质分离，通过差速离心分离线粒体。利用免疫印迹（immunoblotting）检测乙酰化赖氨酸水平及特定蛋白（如SIRT3、SHMT2、PCCA等）。使用抗乙酰赖氨酸抗体进行免疫沉淀（IP）验证乙酰化蛋白。

3. **转录组与代谢分析**：采用RNA-seq（数据已提交GEO）和qPCR检测KATs和KDACs的mRNA表达。通过LC-MS（液相色谱-质谱联用）进行代谢组学分析，包括靶向定量NAD⁺、NADH及代谢物（如丝氨酸、甘氨酸、丙酰肉碱等）。乙酰化蛋白质组学由PTM Bio公司完成，包括胰酶消化后乙酰赖氨酸肽段的免疫沉淀及质谱鉴定。

4. **呼吸测量**：使用Oroboros Oxygraph-2k高分辨率呼吸仪测量离体浮游脂肪细胞的耗氧量，包括基础呼吸、质子漏呼吸、最大呼吸及ATP相关呼吸。

**研究结果**

**3.1 低温离体增强线粒体呼吸**：将小鼠饲养于22^oC（相对于30^oC）12周后，从后皮下白色脂肪组织（psWAT）分离的脂肪细胞在Oroboros分析中表现出显著增加的基础呼吸、最大呼吸和备用容量，而ATP相关呼吸无变化，表明低温增强了非ATP消耗的氧利用（如质子漏和底物氧化）及线粒体氧化潜力。

**3.2 低温适应降低全局蛋白质乙酰化，独立于营养状态且可逆**：小鼠和人类脂肪细胞及前体细胞在31^oC培养后，全细胞裂解液中乙酰化赖氨酸水平显著降低，且该效应与血清浓度（2%或10%FBS）无关。乳腺癌细胞系（BT474、MCF7）也表现出类似但程度不同的低乙酰化。将31^oC适应后的细胞重新转回37^oC，乙酰化水平在4天内恢复至基线，表明此过程动态可逆。

**3.3 线粒体是37^oC下蛋白质乙酰化的主要来源，低温适应全局降低**：通过亚细胞分级分离，发现低温适应主要降低细胞质（含线粒体）部分的乙酰化，而核部分乙酰化也进一步减少。分离线粒体后比较全细胞裂解液，证实线粒体是37^oC下乙酰化蛋白的主要储库，且低温适应明显减少线粒体乙酰化信号。

**3.4 低温下蛋白质乙酰化机器的调控**：RNA-seq显示KATs和KDACs整体表达无显著变化，但qPCR检测到部分核KATs（Kat2b、Kat3a、Kat5等）mRNA在31^oC下降，而Hdac11和Sirt3 mRNA轻微上升。然而，线粒体SIRT3蛋白（前体和成熟形式）及其辅因子NAD⁺浓度均未受温度影响。SIRT3抑制剂3-TYP在37^oC下轻微增加乙酰化，但在31^oC下无效，表明SIRT3活性不足以逆转低温诱导的低乙酰化，提示存在替代机制。

**3.5 调节乙酰辅酶A代谢不能改变31^oC下的蛋白质乙酰化**：使用乙酰辅酶A羧化酶（ACC）抑制剂TOFA和ND630、乙酸钠、线粒体丙酮酸载体抑制剂UK5099、非酯化脂肪酸（NEFA）或肉碱棕榈酰转移酶1（CPT1）抑制剂Etomoxir处理细胞，均未能增加31^oC下的乙酰化水平。仅在37^oC下，乙酸钠可增加乙酰化，但31^oC下无此效应。表明传统乙酰辅酶A合成途径的调控不足以解释低温下低乙酰化。

**3.6 整合蛋白质组学和代谢组学揭示温度依赖的乙酰化与代谢变化**：通过乙酰化蛋白质组学（数据已提交PRIDE，PXD079423）和代谢组学（Metabolomics Workbench，ST004911），发现SHMT2和PCCA在37^oC下高度乙酰化，且与代谢物水平相关。免疫沉淀验证了SHMT2和PCCA的乙酰化在37^oC高于31^oC，而丙酮酸羧化酶（PC）无变化。代谢组学显示，37^oC下丝氨酸升高、甘氨酸降低（与SHMT2乙酰化增强一致），丙酰肉碱（C3）降低而乙酰肉碱（C2）不变（C3/C2比值变化支持PCCA活性受乙酰化调控）。

**总结讨论与结论**

讨论部分指出，低温诱导的蛋白质低乙酰化不能由KAT/KDAC表达或乙酰辅酶A可用性完全解释，而可能涉及乙酰辅酶A区室化通量、非经典翻译后修饰或温度敏感的蛋白质相互作用。与体内棕色脂肪组织（BAT）中SIRT3敲除导致高乙酰化不同，本研究中SIRT3活性未受温度影响，且药理抑制无法逆转低乙酰化，表明低温通过不同于经典SIRT3轴的机制调控线粒体乙酰化。此外，与癌症研究中对SHMT2 K95/K200乙酰化的报道一致，本研究中SHMT2在K103、K305、K464、K469位点乙酰化升高与丝氨酸/甘氨酸代谢变化相关；PCCA在K61、K184位点乙酰化升高与丙酸通量变化相关，提示温度敏感乙酰化可作为代谢通量的微调器。

**研究结论**：总之，这些发现确立了生理相关冷却作为脂肪细胞中线粒体蛋白质乙酰化和代谢适应的细胞自主调节因子。