《The FASEB Journal》：Modification of the Transcription Factor FOXL2 at Serines 101 and 107 Disables DNA Binding, Leads to Nucleolar Relocalization, and Rewires Granulosa-Cell Programs
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FOXL2是一种叉头转录因子（forkhead transcription factor，TF），对颗粒细胞（granulosa cell，GC）的识别和功能至关重要，然而翻译后修饰（post-translational modification，PTM）如何
FOXL2是一种叉头转录因子（forkhead transcription factor，TF），对颗粒细胞（granulosa cell，GC）的识别和功能至关重要，然而翻译后修饰（post-translational modification，PTM）如何调节其活性仍不完全清楚。在此，研究人员表明蛋白激酶C（protein kinase C，PKC）在体外磷酸化FOXL2。四个磷酸化位点中的两个，特别是Ser101和Ser107，映射到叉头DNA识别螺旋（forkhead DNA-recognition helix）。在这些位点上的磷酸模拟替代（S→D）（S101D/S107D）消除了FOXL2识别的共有DNA序列的结合以及荧光素酶报告基因的激活，而丙氨酸替代则相对中性。在HeLa细胞中，S101D突变体，以及较小程度的S107A/S107D，至少部分重新定位到核仁，并表现出与DNA结合减少一致的增强的迁移率。这种模式在稳定转导的KGN颗粒细胞中得以重现。对这些KGN细胞的RNA测序揭示，相对于野生型（wild-type，WT）FOXL2，S101D和C端截短（ΔC）诱导了大规模的功能丧失（loss-of-function，LOF）。这种LOF影响涉及颗粒细胞生理核心通路的基因集，包括细胞外基质（extracellular matrix，ECM）组织、细胞迁移/黏附以及丝裂原活化蛋白激酶（mitogen-activated protein kinase，MAPK）级联反应，而S101A则大致与WT相似。通过质谱（mass spectrometry，MS）分析转导细胞中FOXL2的相互作用组，显示S101D失去了与众多转录因子（TF）和染色质重塑因子以及Pol I/III调控因子（如UBTF和TFIIIC组分）的相互作用，同时获得了其他伙伴。相比之下，ΔC保留了WT的许多蛋白质-蛋白质接触，并优先失去核糖体/TFIII相互作用。总之，这些数据使研究人员假设，FOXL2 DNA识别螺旋内依赖PKC的磷酸化可能构成一个快速、可逆的开关，削弱DNA结合，重新定向亚核分区，并重塑蛋白质-蛋白质相互作用，从而重塑颗粒细胞中依赖FOXL2的基因调控。
**论文解读：转录因子FOXL2磷酸化修饰调控颗粒细胞程序的分子机制**
**研究背景与问题**
FOXL2是一种叉头转录因子（forkhead transcription factor, TF），在脊椎动物中高度保守，是卵巢颗粒细胞（granulosa cell, GC）身份维持和功能执行的关键调控因子。其致病性变异导致小睑裂-上睑下垂-内眦赘皮综合征（Blepharophimosis Ptosis Epicanthus Inversus syndrome, BPES），并常伴随女性不育；此外，大多数成人型颗粒细胞瘤（adult-type granulosa-cell tumor, AGCT）中携带体细胞错义突变p.C134W。FOXL2参与细胞凋亡、增殖调控、细胞周期控制、类固醇生成及活性氧解毒等多种细胞过程。其组成性敲除导致卵泡大量闭锁，条件性敲除则引起卵巢“雄性化”，表明FOXL2是卵巢发育和维持所必需的，负责抑制睾丸分化通路基因（如SRY-box转录因子9，Sox9）的表达。
尽管已知FOXL2经历多种翻译后修饰（post-translational modification, PTM），包括乙酰化、SUMO化和磷酸化，但这些修饰如何调节其活性仍不完全清楚。特别地，对于FOXL2的磷酸化、相关蛋白激酶（protein kinase, PK）以及该PTM对其功能的影响，知之甚少。已有研究报道LATS1和GSK3B可磷酸化FOXL2，但关于蛋白激酶C（protein kinase C, PKC）——一种在卵泡发育和命运决定中起关键作用的激酶——对FOXL2的调控作用尚属空白。鉴于PKC信号在介导促黄体生成素（luteinizing hormone, LH）对颗粒细胞分化和卵泡成熟（最终排卵）中的重要作用，研究PKC对FOXL2的磷酸化修饰及其功能后果，对于理解颗粒细胞生理和病理机制具有重要意义。
**研究目的**
本研究旨在阐明PKC是否磷酸化FOXL2、鉴定磷酸化位点，并探究这些位点的磷酸化对FOXL2 DNA结合能力、亚细胞定位、蛋白质相互作用（protein-protein interaction, PPI）以及转录调控程序的影响，从而揭示一种可逆的分子开关机制，调控FOXL2在颗粒细胞中的活性。
**主要技术方法**
研究人员采用以下关键技术：1）体外磷酸化实验结合质谱（mass spectrometry, MS）鉴定PKC磷酸化FOXL2的位点；2）荧光素酶报告基因实验（luciferase assay）评估突变体对FOXL2转录活性的影响；3）电泳迁移率变动分析（electrophoretic mobility shift assay, EMSA）检测DNA结合能力；4）荧光显微镜观察和荧光漂白后恢复（fluorescence recovery after photobleaching, FRAP）分析亚细胞定位和蛋白质迁移率；5）RNA测序（RNA-seq）分析转导的KGN颗粒细胞（来源于人颗粒细胞瘤细胞系，但本研究使用的KGN细胞经CRISPR/Cas9改造为FOXL2 WT/WT且内源表达较低）的转录组变化；6）免疫沉淀联合质谱（immunoprecipitation-MS, IP-MS）分析FOXL2相互作用组。样本来源：KGN细胞系（女性患者来源），HeLa细胞系（女性患者来源），293T细胞（用于慢病毒包装）。
**研究结果**
**3.1 FOXL2 Ser101和Ser107的修饰调节其活性**
体外磷酸化实验表明PKCα可磷酸化FOXL2。MS分析鉴定出四个磷酸化位点：S101、S107（位于叉头结构域FHD的第三螺旋H3）以及S263、S372（位于C端结构域）。通过构建丙氨酸（A，模拟非磷酸化状态）和天冬氨酸（D，模拟磷酸化状态）替代突变体，发现S101A和S107A降低转录活性，而S101D和S107D完全丧失对FOXL2响应启动子（p16/INK4a、pAT29C-luc、3×GRAS-luc）的激活能力，表明负电荷导入导致转录活性崩溃。EMSA实验显示，S101A仍能结合DNA甚至更强，S107A结合减弱，而S101D和S107D完全丧失与叉头共有序列的结合。AlphaFold模拟进一步揭示，S107磷酸化破坏了与DNA T15位点的氢键。
**3.2 FOXL2 S101/S107突变体的核仁富集和快速动力学**
在HeLa细胞中，S101D、S107A和S107D突变体（而非WT或S101A）表现出明显的核仁富集（与核仁标记Nucleolus Bright Red共定位），且无蛋白聚集。FRAP分析显示，这些核仁富集的突变体（S101D、S107A、S107D）的荧光恢复半衰期（t
1/2）显著短于WT FOXL2，表明其迁移率更高，与DNA结合减弱一致。在稳定转导的KGN细胞中，S101A定位与WT相似，而S101D几乎全部富集于核仁，验证了结果的细胞系普适性。
**3.3 S101D磷酸模拟替代和C端缺失影响KGN细胞中FOXL2依赖的转录**
RNA-seq分析显示，WT FOXL2调控159个差异表达基因（differentially expressed gene, DEG），富集于ECM组织、细胞迁移/黏附、MAPK级联等颗粒细胞生理通路。S101A突变体仅导致11个基因功能丧失（LOF），且其保留的39个基因表达模式与WT高度相似，表明S101A基本保持WT功能。相比之下，S101D和ΔC（C端截短，缺失第153-376残基）分别导致83个和103个基因LOF，且无基因表达水平与WT一致，表明完全的转录活性丧失。这些LOF基因富集的通路与WT FOXL2调控的通路高度重叠，但方向相反，提示S101D和ΔC“关闭”了WT的调控程序。
**3.4 FOXL2突变改变其与伙伴蛋白的相互作用**
Interactome分析显示，WT FOXL2与280种蛋白质相互作用，富集于DNA复制与修复、细胞周期、核糖体生物合成、染色质重塑等过程，并包含大量核仁蛋白（如核仁素nucleolin，UBTF）。S101A突变体仅改变少量相互作用（5个丢失，13个获得）。S101D突变体导致96个相互作用丢失（lost/decreased interaction, LOI），包括大量RNA聚合酶II相关转录因子（如JUN、RUNX1、TEAD1/3）、染色质重塑因子（HLTF、MECP2、SMARCA5）、Pol I/III调控因子（UBTF、TFIIIC组分）以及DNA修复蛋白（XRCC5/6、RPA复合物）；同时获得63个相互作用（gained/increased interaction, GOI），富集于黏着斑、Rho GTPase信号通路等。此外，S101D保留了71个相互作用，包括一些核糖体蛋白（ribosomal protein, RP）和TFIIIC组分（GTF3C1/2/3）。ΔC突变体仅丢失26个相互作用，主要包括RP（RPL2/13/24/28）和TFIIIC组分（GTF3C1/3C3），但保留了大部分WT的PPI（72个），特别是与Pol II相关因子的相互作用。
**结论**
本研究证明PKC可在体外磷酸化FOXL2的S101和S107位点（位于FHD的DNA识别螺旋）。磷酸模拟替代S101D（以及S107D）完全消除DNA结合，导致转录活性崩溃、核仁富集和蛋白质相互作用组的重编程：失去与DNA/染色质结合状态相关的转录因子、染色质重塑因子和Pol I/III调控因子的相互作用，同时获得与Rho GTPase信号等通路相关的新伙伴。C端截短（ΔC）在转录水平上同样导致大规模LOF，但保留了大部分WT的PPI，主要失去与核糖体蛋白和TFIIIC的相互作用。这些发现支持一个模型：PKC依赖的FOXL2 DNA识别螺旋磷酸化构成一个快速可逆的开关，削弱DNA结合，将FOXL2重新定向至核仁，并重塑其PPI网络，从而改变颗粒细胞中FOXL2依赖的基因调控程序。该机制可能为快速沉默FOXL2转录程序而不依赖蛋白质降解提供了一种可逆途径。
