发育中小鼠抑制性神经元单细胞转录组揭示细胞类型多样化的不同模式

《Nature Neuroscience》：Developing mouse inhibitory neuron single-cell transcriptomes reveal distinct modes of cell-type diversification

　　

大脑皮层依赖于多种多样的抑制性神经元，然而这种多样性在发育过程中如何出现仍不清楚。罕见的抑制性亚型在单细胞RNA测序（scRNA-seq）数据集中往往代表性不足，限制了其发育轨迹的分辨率。在此，研究人员开发了一种计算流程，用于富集和整合跨数据集的稀有细胞类型，并将其应用于生长抑素阳性（SST⁺）抑制性神经元，这是皮层中最多样化的抑制性类别。研究人员生成了Dev-SST-v1和Dev-SST-v2，这两个转录组参考图谱包含超过55,000个小鼠SST⁺神经元。这些图谱识别出三个主要的SST⁺抑制性神经元群——Martinotti细胞（MCs）、非Martinotti细胞（nMCs）和长程投射（LRP）神经元——每个群均由不同的发育策略定义。MCs早期定型，而nMCs逐渐多样化。LRPs遵循一个收缩轨迹，其中一个短暂亚型通过程序性细胞死亡（PCD）被消除。总之，这些发现确立了SST⁺抑制性神经元多样化的三种不同模式，包括一种先前未被认识的收缩模式。

**论文解读：发育中小鼠抑制性神经元单细胞转录组揭示细胞类型多样化的不同模式**

**研究背景与问题**

大脑皮层依赖高度多样化的抑制性神经元（interneurons）来协调信息处理、网络同步和回路稳态，其发育失调与癫痫、精神分裂症和自闭症等疾病相关。然而，抑制性神经元多样性在发育过程中如何产生仍不清楚。单细胞RNA测序（scRNA-seq）技术为研究细胞异质性提供了有力工具，但抑制性神经元在皮层中仅占约15%，其中生长抑素阳性（SST⁺）神经元虽然是最多样化的抑制性类别，却因数量稀少而在大多数数据集中代表性不足，尤其在发育早期，其转录谱被未成熟特征主导，进一步掩盖了细胞多样性。以往研究受限于样本量，难以解析其精细发育轨迹。因此，亟需开发一种系统性的方法，以富集稀有细胞类型并整合跨数据集资源，从而重建SST⁺抑制性神经元的发育历程。

**研究内容与意义**

本研究发表在《Nature Neuroscience》上。研究人员开发了一个模块化计算流程，用于从多个公开和自产数据集中富集和整合稀有SST⁺抑制性神经元，构建了迄今为止最大的发育图谱Dev-SST-v1和Dev-SST-v2（包含超过55,000个细胞）。该图谱揭示了SST⁺神经元存在三种不同的多样化模式：Martinotti细胞（MCs）遵循不变（invariant）轨迹，早期即与成年细胞类型高度对应；非Martinotti细胞（nMCs）遵循扩展（expanding）轨迹，从单一新生集群逐步分化出多种成年类型；长程投射（LRP）神经元则遵循一种先前未被认识的收缩（contracting）轨迹，其中一个短暂亚型（LRP2.1）在出生后通过程序性细胞死亡（PCD）被选择性消除。这一发现不仅为理解皮层抑制性神经元多样性提供了基本资源，还揭示了细胞类型多样性可通过选择性细胞死亡进行精细调控的保守机制，在人类发育皮层中也得到验证。

**主要关键技术方法**

研究人员采用了一个三模块计算流程：模块1从公开数据库（跨越E12.5至P10，共18个数据集）以及自产数据集（包括E16.5至P5的Sst^Cre;RCE小鼠皮层样本，通过荧光激活细胞分选（FACS）富集SST⁺细胞）中提取SST⁺细胞；模块2通过锚点分析、k-最近邻（k-NN）结构一致性和k-BET批次混合测试三个标准评估数据集的可整合性；模块3使用Seurat的典型相关分析（CCA）进行跨数据集整合，并结合迭代聚类构建图谱。此外，还使用了MapMyCells进行成年细胞类型映射、Waddington最优传输（WOT）验证发育关系、MERFISH空间转录组学（基于~500基因探针）验证细胞类型空间分布，以及双光子电生理记录、病毒示踪（AAV和狂犬病毒）和免疫组化等技术验证功能性连接和细胞命运。

**研究结果**

**1. 发育中的SST⁺抑制性神经元在大多数scRNA-seq数据集中代表性不足**
通过模块1分析18个数据集，发现仅7个数据集包含超过1000个SST⁺细胞。研究人员利用最大数据集（约19,000个SST⁺细胞）构建了初始参考图谱Dev-SST-v0，并通过MapMyCells映射到成年抑制性神经元参考，证实超过75%的细胞以高置信度（>0.9概率）对齐到成年SST⁺亚类，表明模块1能有效提取稀有细胞类型。

**2. 评估不同数据集可整合性的通用计算流程**
模块2定义了三个可整合性标准：标准化平均锚点数>1,686、k-NN（k=60）中至少50%的细胞与参考图谱结构一致、k-BET拒绝率<0.5。在13个测试数据集中，7个通过全部标准。通过标准的数据集显示出更高的平均RNA计数和基因数，以及更低的细胞丢失率，表明这些标准可作为严格的质量过滤器。该流程也成功应用于成年脊髓和发育中PV⁺中间神经元数据，证明其通用性。

**3. 可整合性标准不依赖于测序深度**
对同一数据集进行浅层（约8,227 reads/细胞）和深层（约61,384 reads/细胞）测序，两者均通过可整合性标准，表明测序深度本身不足以解释整合失败，其他参数可能影响整合性。

**4. Dev-SST-v2揭示26个皮层SST⁺抑制性神经元聚类**
通过整合通过模块2标准的数据集，最终生成Dev-SST-v2（59,658个细胞）。迭代聚类识别出26个稳定聚类（Jaccard指数>0.75），包括18个MC聚类、6个nMC聚类和2个LRP聚类（LRP1和LRP2.1），以及非皮层稀有聚类。与之前研究相比，MC聚类数量从3个扩增至18个，分辨率大幅提升。WOT分析独立验证了聚类间的发育连续性。

**5. 皮层SST⁺中间神经元呈现异质性的多样化模式**
通过MapMyCells将发育聚类映射到成年亚类和超型，发现7个MC聚类与成年超型呈一对一关系，而nMC聚类多映射到多个成年超型。进一步分析表明，10个成年超型主要由发育MC衍生，3个主要由nMC衍生。P5的MERFISH空间数据验证了多个聚类具有独特的皮层分层分布，且与成年对应超型的空间分布高度一致，表明聚类具有生物学意义。相对丰度分析显示，大多数SST⁺超型的比例在出生后继续变化，并非早期固定。

**6. LRP1和LRP2.1是具有不同发育轨迹的细胞类型**
LRP1映射到成年皮层特异性超型Sst-Chodl-Gaba-2（超型241），而LRP2.1映射到成年纹状体特异性超型Sst-Chodl-Gaba-4（超型239）。通过整合P5皮层和纹状体SST⁺细胞数据，发现LRP2.1与皮层LRP1和纹状体SST⁺中间神经元均有部分转录组重叠，但通过关键基因（如Rora、Kncip4等）可区分。E18.5神经节隆起的重新分析进一步证实LRP1、LRP2.1和纹状体SST⁺中间神经元在迁移前即为三个独立聚类。伪时间分析显示LRP1和LRP2.1在早期即分离为两个分支，表达分支特异性基因，表明它们是两种不同的细胞类型而非状态。

**7. LRP2.1是短暂存在的细胞群体，在小鼠皮层中从P5到成年期减少**
在Dev-SST-v2中，LRP2.1在E16.5占所有LRP的~25%，至P5增至~55%。但重新分析独立snRNA-seq数据发现，LRP2.1丰度在P5达到峰值后迅速下降，至成年期低于10%。通过组织学（使用AAV标记LRP并进行Dach1/MafB免疫染色）验证，P5时LRP1和LRP2.1比例接近相等，但P7时LRP2.1显著减少（P<0.001），至P21仅约18%为LRP2.1阳性，证实LRP2.1是短暂细胞类型。

**8. 程序性细胞死亡（PCD）选择性清除小鼠皮层中的LRP2.1**
重新分析Bax条件敲除（cKO）小鼠（抑制PCD）的snRNA-seq数据发现，在对照小鼠中LRP2.1丰度在P2至P7间急剧下降，至P14完全消失；而在Bax cKO小鼠中，LRP2.1在P14仍维持在~25%水平（P<0.001），表明其丧失依赖于PCD，且其他SST⁺亚型丰度无显著变化，证明PCD对LRP2.1具有选择性。

**9. LRP2.1在人发育皮层中出现并在出生前减少**
重新分析两个独立的人类胎儿、儿童和成人皮层scRNA-seq数据集，发现hLRP2.1在妊娠18-20周（GW18-20）约占LRP的50%，而在出生时急剧下降。hPSC来源的MGE中间神经元异种移植到小鼠皮层的数据也显示类似趋势，在移植后1个月最丰富，3个月后显著减少，表明LRP2.1的选择性消除在哺乳动物中进化保守。

**10. 在P4-P6期间，LRP2.1神经元与皮层和丘脑兴奋性神经元相连**
狂犬病毒逆行示踪显示，LRP神经元（包括LRP1和LRP2.1）在P4-P8期间与丘脑、深层皮层和底板神经元形成单突触连接。通过EdU标记发现LRP2.1的出生峰值晚于LRP1（E13.5 vs E12.5）。在丘脑皮层切片中，电生理记录显示两种LRP亚型在P5-P6均接受丘脑兴奋性输入，且诱发的EPSC成功率、潜伏期抖动和幅值无显著差异。但在切断丘脑传入的皮层切片中，LRP2.1的自发性EPSC频率显著低于LRP1（P<0.01），表明它们在接受皮层兴奋性输入上存在差异，说明LRP2.1在消失前已参与皮层和丘脑回路。

**总结与结论**

**讨论部分总结**：模块化计算流程有效解决了稀有细胞类型的富集与跨数据集整合难题，但成功整合依赖于技术兼容性，反映了当前交叉研究的局限性。Dev-SST-v2通过七倍采样增加和基于MapMyCells的细胞注释扩展了先前图谱，揭示了三种多样化模式：不变（invariant）、扩展（expanding）和收缩（contracting）。其中，LRP的收缩轨迹为选择性细胞死亡精确塑造抑制性神经元多样性提供了新机制。该机制在人类中保守，hLRP2.1在GW18-20达到峰值后通过PCD在出生前消除。LRP2.1作为短暂神经元群体，在消失前参与回路连接，其功能类似底板神经元和Cajal-Retzius细胞等支架性群体，可能影响皮层发育。

**研究结论**：总之，本研究提出了一种模块化scRNA-seq计算流程，用于富集和整合稀有神经元群体，从而构建了迄今为止最全面的SST⁺皮层中间神经元发育图谱。研究人员揭示了神经元多样化的三种不同模式——不变（invariant）、扩展（expanding）和收缩（contracting）。值得注意的是，研究人员描述了LRPs中一种独特的收缩轨迹，其中早期多样性通过选择性PCD被缩减。此外，研究人员鉴定了一种短暂存在的细胞类型，称为长程抑制性少数群体神经元，该类型在进化上保守。这些发现为理解神经元多样性在哺乳动物皮层发育过程中如何产生和精炼提供了丰富的数据基础。