用双光子全息介观显微镜探究区域间计算

《Nature Neuroscience》：Probing inter-areal computations with a two-photon holographic mesoscope

　　

脑计算依赖于错综复杂连接且高度分布式的神经网络。由于缺乏必要技术，因果性地检验关于区域间处理的基本假设在很大程度上仍难以实现。在此，研究人员开发了一种双光子全息介观显微镜（two-photon holographic mesoscope），能够在小鼠皮层（mouse cortex）的大片区域以近单细胞分辨率（near-single-cell resolution）同时读取和写入神经活动模式。研究人员展示了在一个或多个皮层区域中精确光激活（photoactivation）神经元的时空序列，同时读取其他几个区域的下游效应。因此，研究人员建立了介尺度双光子全息光遗传学（mesoscale two-photon holographic optogenetics）作为在高分辨率下跨分布式皮层区域绘制功能连接（functional connectivity）和因果相互作用（causal interactions）的平台。

**论文解读文章**

**研究背景与问题**
脑功能依赖于广泛分布且精密连接的神经网络的协同活动。然而，由于缺乏能够在因果层面检验跨区域信息处理假说的技术，神经科学家长期无法直接探究区域间通信的逻辑与原理。现有双光子（two-photon, 2p）显微镜虽能以近微米精度监测大面积皮层（如5 mm × 5 mm视场）的神经活动，但无法进行空间靶向的扰动，因而无法建立特定神经群体活动与行为之间的因果联系。更先进的全息光遗传学（holographic optogenetics）虽能实现精准光刺激，但受限于空间光调制器（spatial light modulator, SLM）的物理限制，其光刺激视场（field-of-view, FOV）通常小于1–2 mm2，无法应用于分布式脑网络。因此，开发一种既能高通量记录又能高分辨率操控皮层大片区域神经活动的技术平台，成为理解区域间计算的核心需求。

**研究内容与意义**
研究人员设计并验证了首个双光子全息介观显微镜（two-photon holographic mesoscope），该平台整合了三维稀疏全息光遗传学与时间聚焦（3D-SHOT）技术，实现近单细胞分辨率（lateral ~9 μm, axial ~32 μm）的靶向光刺激，并与双光子随机访问介观显微镜（2p-RAM）结合，可同时记录5 mm × 5 mm FOV内数千个神经元的钙活动。通过引入随机访问扫描模块（XY galvanometer scanners），将光刺激FOV扩展至10倍以上（约3.2 mm × 3.2 mm），并实现快速交变刺激远端神经群体。该研究在小鼠（mus musculus）视觉皮层活体实验中验证了系统能力：可光激活特定功能偏好（如朝向选择性）的神经元集群，并解码其下游效应；可构建跨皮层区域的因果功能连接图谱；并首次实现近同时刺激多个远程皮层区域。该技术发表在《Nature Neuroscience》，为神经科学提供了一种全新的因果实验范式，有望推动系统神经科学中关于区域间信息处理的核心假说检验。

**主要关键技术方法**
研究人员基于商用的2p-RAM系统（Thorlabs）构建了介尺度读写平台。核心方法包括：（1）三维稀疏全息光遗传学与时间聚焦（3D-SHOT）模块，利用SLM生成三维光斑，通过时间聚焦（temporal focusing）限制轴向激发范围（~30 μm），实现近单细胞分辨率；（2）随机访问扫描模块，将XY振镜（galvanometer scanners）共轭到SLM和物镜后焦面，通过快速偏转SLM FOV中心位置，将光刺激FOV从~1 mm2扩展至>10 mm2（3.2 mm × 3.2 mm），并支持快速交变刺激（52.6 Hz交变率）；（3）全光学系统校准与共对准，通过自动程序校正SLM至真实空间变换矩阵，确保刺激与成像的精确匹配。样本来源：使用Vglut1-Cre; Ai203转基因小鼠（表达ChroME和GCaMP7s）、CaMK2-tTA; tetO-GCaMP6s转基因小鼠及局部注射AAV（pAAV-hSyn-GCaMP6m-p2A-ChRmine-Kv2.1-WPRE或AAV9-CAG.DIO.ChroME2s）的病毒表达模型。

**研究结果**

**1. 具有时间聚焦双光子全息照明的2p-RAM**
研究人员设计并优化了集成于2p-RAM系统的3D-SHOT全息模块。通过测量点扩散函数（PSF），得到横向FWHM为9±0.7 μm，轴向FWHM为32±1.6 μm（n=551个全息图），光刺激FOV约950×990 μm。通过数字离焦补偿，轴向PSF在220 μm范围内基本不变。系统对X、Y平移和旋转表现出良好的对准不变性（误差<3 μm）。

**2. 在2p-RAM上进行活体双光子光刺激**
在清醒小鼠（Vglut1-Cre; Ai203转基因或AAV注射）中，以75 mW/点、10×10 ms脉冲（50 Hz）刺激，70%靶向细胞产生锁时响应。通过测量生理PSF（PPSF），发现横向PPSF为23–38 μm，轴向PPSF为35–77 μm（随功率增加而增大），表明在低功率下可实现近单细胞分辨率。通过平移显微镜，研究人员能依次刺激四个不同视觉皮层区域（V1、PM、RL、LM），并同时记录周围六个区域的活动。

**3. 信息在皮层区域间的特异性传递**
在LM区域刺激不同神经元集群（3–20个细胞），从下游区域（排除LM）的群体活动中解码刺激身份，解码准确率显著高于随机水平（P<0.001）。进一步，研究人员基于V1神经元的朝向偏好，构建共调谐神经元集群（0°/45°/90°/135°），通过全息光刺激激活这些集群，并训练一个仅基于视觉刺激响应的分类器。在无视觉刺激时，该分类器能根据光刺激诱发的神经活动模式，将全息试验正确归类到对应的朝向偏好（匹配朝向准确率31.6% vs. 不同朝向22.8%，P=0.0098），且仅使用下游纹外皮层神经元解码时仍显著高于随机水平（P=0.04）。这表明系统能写入并传递视觉相关的功能信息。

**4. 使用随机访问3D-SHOT进行介观FOV光刺激**
通过在光路中集成XY振镜扫描模块，将光刺激FOV扩展至3.2 mm × 3.2 mm（约10倍）。系统将介观FOV划分为81个350 μm × 350 μm象限，每个象限对应唯一振镜位置。轴向分辨率在大部分区域保持在50 μm以下，边缘最差约56 μm。通过动态更新每个振镜位置对应的全息相位掩模，研究人员能在同一实验中按随机化逐试次方式，成功靶向并刺激不同皮层区域（如V1和LM）的用户定义神经元集群。

**5. 皮层区域间功能连接的因果图谱**
在3.1 mm × 3.1 mm FOV（3 Hz）中，刺激V1或LM的神经元集群，并记录超过七个其他皮层区域的活动。研究人员定义了“跟随细胞”（follower cells）——在两次非重叠试次分割中均显著调制的细胞。定量分析显示，局部网络（距靶点100–1000 μm内）的调制强度显著强于远端网络（Mann–Whitney P=7.14×10^?28）。局部网络呈现净抑制效应，而远端网络呈现净兴奋效应。基于此，研究人员构建了跨皮层区域的因果功能连接图（net influence），表明V1和LM的刺激可诱发不同区域的特异性兴奋/抑制模式。

**6. 快速交变刺激远端皮层群体**
利用振镜的高速扫描和SLM快速刷新（52.6 Hz交变率），研究人员实现了在10 Hz脉冲刺激下，对V1和LM两个远端神经集群的快速交变刺激（接近同时激活）。通过比较单独刺激与联合刺激的效果，发现联合刺激引起的下游神经元调制幅度通常小于单独刺激之和（亚线性叠加），提示可能存在归一化机制。该实验展示了平台对于探究长程投射通路非线性整合的潜力。

**讨论与结论**
研究人员设计、构建并验证了首个多光子全息介观显微镜。该技术提供近单细胞分辨率的靶向光刺激，同时可在大面积连续介观FOV中记录多个皮层区域的神经活动。通过在光刺激系统中集成扫描模块，将可访问光刺激FOV扩大了一个数量级，并实现了快速交变刺激空间远程神经群体。该系统能够根据空间或功能特性选择用户定义的神经元群体进行共激活，同时记录下游区域活动。值得注意地，研究人员发现特定功能相关信息可被全息写入并传播至下游网络。研究人员能够识别出数百甚至数千微米外显示锁时兴奋或抑制反应的单个下游神经元。研究表明，该方法为基于靶向因果扰动构建跨皮层区域功能连接图谱奠定了基础。整体而言，这证明了该新技术可用于在同一实验中探究局部和长程功能相互作用如何与特定神经元计算相关联。研究结论指出，该平台将促进对区域间通信主要假说（如预测编码框架）的实验检验，并为脑机接口设计和大脑（如灵长类）的规模化全息光遗传学提供新途径。