综述：流感疫苗临床免疫原性评估的进展

《Vaccine》：Advances in clinical immunogenicity evaluation of influenza vaccines

　　

流感疫苗接种是预防重症流感的有效干预措施，评估其免疫原性是确定疫苗保护效力的关键步骤。随着流感疫苗——包括裂解病毒疫苗、亚单位疫苗、重组蛋白疫苗和减毒活疫苗——的广泛使用，免疫原性评估方法日益多样化和复杂化。本文系统梳理了流感疫苗各种免疫原性评估方法的优势与局限性，借鉴了涵盖体液免疫、细胞免疫和黏膜免疫的多维度评估框架，并整合了血凝抑制试验（HAI）、微量中和试验（MN）、酶联免疫吸附试验（ELISA）、黏膜分泌型IgA（sIgA）检测、酶联免疫斑点试验（ELISPOT）和流式细胞术（FCM）等分析技术。此外，临床挑战试验评估在阐明免疫原性与保护效力之间的关系中发挥着重要作用。本文旨在为流感疫苗的开发和免疫原性评估建立系统全面的参考框架，从而推动疫苗设计和保护效果预测向更精准的方向发展。

1. 概述
流感病毒引起急性呼吸道疾病，导致季节性流行和大流行，每年全球有数百万重症病例和数十万死亡。疫苗接种是最具成本效益的预防措施，但病毒高突变性导致免疫逃逸。世界卫生组织（WHO）根据全球流感监测与响应系统（GISRS）数据每年更新疫苗株推荐。目前最广泛使用的是注射用三价和四价裂解病毒疫苗，通过经典重配或反向遗传技术生产。鼻内流感疫苗具有独特的黏膜-系统免疫机制和广谱保护潜力。然而，免疫原性评估面临挑战，如鸡胚传代导致的适应性突变，需评估试剂与疫苗生产底物同源。当前监管框架主要依赖血凝抑制试验（HAI）抗体滴度，但这仅反映血凝素（HA）靶向功能抗体，且与保护效力的关联可能因人群和疫苗平台而异。现有评估方法不足以预测长期免疫或交叉保护，需新的免疫指标评估新兴疫苗技术，如通用疫苗和mRNA疫苗。此外，肌肉注射疫苗不能有效诱导黏膜分泌型IgA（sIgA），而鼻内疫苗可诱导组织驻留记忆T细胞。因此，需建立整合体液、细胞和黏膜免疫及病毒攻击研究的综合评估体系。

2. 流感疫苗平台概述
2.1. 流感裂解病毒疫苗
广泛使用，通过鸡胚培养，化学或物理裂解病毒颗粒，纯化保留血凝素（HA）抗原。高剂量加强疫苗含四倍抗原。主要诱导体液免疫。由于B/Yamagata谱系自2020年3月后未检测到，WHO建议不再包含该谱系抗原。常见疫苗如Vaxigrip、Fluarix（鸡胚来源）和Flucelvax（MDCK细胞来源）。临床证据表明在健康成人、儿童、老年人和肥胖成人中均可诱导保护性免疫，如Vaxigrip Tetra在肥胖成人中免疫原性符合要求，儿童中效力达68%，老年人中血清转化率和保护率满意。

2.2. 流感亚单位疫苗
进一步纯化，仅含HA和神经氨酸酶（NA），提高安全性和减少不良反应。代表产品Influvac Tetra（Abbott）。

2.3. 流感重组蛋白疫苗
通过重组DNA技术（如杆状病毒-昆虫细胞系统）表达HA蛋白，避免鸡胚适应性突变，保持抗原结构完整性。与纳米颗粒或脂质体结合可增强免疫原性。Matrix-M佐剂的重组疫苗在老年人中显示出安全性和优于标准灭活疫苗的免疫原性。AS01和Advax等佐剂在动物研究中可进一步增强免疫应答。

2.4. 减毒活流感疫苗（鼻喷）
通过鼻内给药模拟自然感染，诱导分泌型IgA（sIgA）和系统免疫。主要技术路线：经典重配（俄罗斯IEM的冻干LAIV）和反向遗传（FluMist）。FluMist使用冷适应温度敏感株，在鼻黏膜31-33℃复制，下呼吸道受限制。2003年获批，2024年FDA批准自我给药。在儿童中应用广泛，随机双盲试验显示抗体滴度升高4倍的比例61%-96%，培养阳性流感显著降低，且减少发热性中耳炎。中国长春百克生物引进技术生产"感雾"疫苗。但LAIV不能100%保护，原因包括疫苗株与流行株不匹配、复制适应性差、预存免疫影响等。

3. 体液免疫
不同技术平台诱导不同免疫应答，需针对性评估。传统评估依赖血清学标志物，如血凝抑制试验（HAI）滴度和中和抗体试验，是金标准。抗体主要靶向HA和NA。HAI和微量中和试验（MN）是最常用方法。假病毒中和试验（PNA）用于高致病性禽流感H5N1疫苗评估。酶联免疫吸附试验（ELISA）和单扩散溶血试验（SRH）也可检测血清抗体。

3.1. 血凝抑制试验（HAI）
基于HA与红细胞结合，抗体抑制血凝。HAI滴度定义为完全抑制4个血凝单位病毒的最高稀释度倒数。≥1:40被广泛接受为保护性相关阈值。标准化至关重要。局限性：主要检测HA头部抗体，忽略NA和茎部；鸡胚传代导致的突变降低敏感性；H3N2病毒可能因NA突变导致非HA介导的血凝。临床常用几何平均滴度（GMT）、血清转化率和血清保护率评估。EMA和FDA等监管机构有具体标准，如成人血清保护率≥70%，血清转化率≥40%，GMT升高>2.5倍。老年人标准稍宽松。

3.2. 微量中和试验（MN）
检测血清中和抗体，直接反映抗体保护水平，比HAI更敏感，EMA已纳入监管框架。与HAI有良好正相关。方法：血清与病毒孵育后接种细胞，通过细胞病变或免疫荧光测定ID₅₀。优点：可检测针对多个抗原的抗体，包括HA茎部和NA，灵敏度高，适合低滴度或交叉反应抗体。缺点：复杂，需细胞培养，费时。改良方法如高内涵成像中和试验（HINT）提高通量和准确性。假病毒中和试验更安全。MDCK-Siat.1细胞可提高病毒扩增。

3.3. 酶联免疫吸附试验（ELISA）
检测流感特异性抗体，可定量IgM、IgA、IgG，区分亚类，支持高通量。但无法区分结合与中和抗体，与保护效力相关性较低，通常作为次要终点。在黏膜免疫评估中常用，如检测sIgA。

3.4. 单扩散溶血试验（SRH）
基于补体介导的溶血，溶血区直径与抗体浓度相关。无需活病毒，安全性好，对禽流感检出灵敏度高于HAI。广泛用于药学研究，而HAI和MN用于临床试验。

4. 细胞免疫
细胞免疫识别保守内部抗原，提供交叉保护。主要评估方法：ELISPOT和流式细胞术（FCM）分析CD4⁺和CD8⁺ T细胞亚群频率、表型和多功能性。mRNA疫苗可诱导更高CD8⁺ T细胞反应。细胞免疫促进IFN-γ、TNF-α等细胞因子释放，减轻症状。动物实验显示亚单位疫苗加细胞免疫增强剂可改善肺部炎症。

4.1. 酶联免疫斑点试验（ELISPOT）
高灵敏度，检测抗原特异性T细胞分泌的细胞因子和B细胞抗体分泌细胞（ASC）。T细胞ELISPOT：细胞接种于包被板，加抗原刺激，捕获细胞因子，显色成斑点，计数频率。B细胞ELISPOT：检测抗原特异性抗体分泌细胞。用于