《International Journal of Molecular Sciences》：Chromatin Accessibility-Guided Targeting Identifies Structurally Constrained Regions in HBV cccDNA and Suppresses Viral Replication
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共价闭合环状DNA（cccDNA）是乙型肝炎病毒（HBV）基因组的稳定附加体形式，作为病毒转录和复制的模板，是HBV治愈的主要障碍。在此，研究人员以单分子分辨率研究了HBV感染肝细胞中cccDNA的染色质可及性模式。研究人员发现，大多数cccDNA拷贝在核苷酸
共价闭合环状DNA（cccDNA）是乙型肝炎病毒（HBV）基因组的稳定附加体形式，作为病毒转录和复制的模板，是HBV治愈的主要障碍。在此，研究人员以单分子分辨率研究了HBV感染肝细胞中cccDNA的染色质可及性模式。研究人员发现，大多数cccDNA拷贝在核苷酸800-1000附近表现出有限的可及性，该区域与聚合酶开放阅读框和前基因组RNA转录区域重叠。值得注意的是，一小部分cccDNA在该位点显示出可检测的可及性，表明存在异质性染色质状态。基于这一观察，研究人员使用基于CRISPR/Cas9的方法靶向该可及性相关区域，并在互补实验系统中观察到HBV DNA相关信号的减少，包括cccDNA富集部分和总HBV DNA水平。这些发现表明，染色质可及性分析可能为识别候选cccDNA靶区域提供额外的框架。研究人员的研究为可及性指导的HBV靶向提供了概念验证，并支持进一步研究HBV cccDNA内的染色质相关脆弱性。
乙型肝炎病毒（HBV）感染是重大公共卫生问题，其共价闭合环状DNA（cccDNA）作为病毒转录和复制的稳定模板，半衰期超过九个月，是实现慢性HBV感染完全治愈的主要障碍。现有抗病毒疗法虽能抑制病毒复制，但难以清除cccDNA。目前对cccDNA的高分辨率结构组织认识不足，尚不清楚cccDNA分子是否结构均匀，或是否存在影响转录活性和基因组编辑易感性的异质性染色质状态。基于序列保守性或功能注释的CRISPR/Cas9靶向策略未考虑cccDNA的染色质可及性，因此需要探索新的靶向框架。为此，研究人员开展了本研究，旨在通过单分子染色质可及性分析揭示cccDNA的结构特征，并验证基于可及性引导的靶向策略能否抑制病毒复制。研究人员在HBV感染的PXB细胞（原代人肝细胞）中，采用转座酶可及性染色质测序（ATAC-seq）以单分子分辨率分析cccDNA染色质可及性模式，鉴定出三个罕见开放染色质区域（rOCRs，即相对可及性降低的区域）。基于其序列保守性和原间隔子邻近基序（PAM）分布，选择800-1000 bp区域的rOCR作为靶点，设计引导RNA（gRNA）并利用CRISPR/Cas9系统进行功能扰动。在Huh7-NTCP（过表达牛磺胆酸钠共转运多肽的Huh7细胞）新生感染模型和HepG2.2.15（稳定携带HBV基因组的肝癌细胞系）持续复制模型中，通过定量PCR（qPCR）和Southern blot评估HBV DNA相关信号，并通过bulk ATAC-seq和RNA测序（RNA-seq）分析宿主染色质和转录响应。研究得出以下结论：染色质可及性分析可识别cccDNA中候选靶区域，可及性引导的靶向策略能抑制病毒复制，为HBV治疗提供了概念验证框架。该论文发表在《International Journal of Molecular Sciences》。
为开展研究，研究人员主要使用了以下关键技术方法：（1）单细胞ATAC-seq（scATAC-seq），用于分析HBV感染PXB细胞（原代人肝细胞，来源于PhoenixBio Co., Ltd.）中cccDNA的单分子染色质可及性；（2）CRISPR/Cas9系统，包括构建Cas9稳定表达细胞系和设计gRNA（靶向839-909 bp区域），通过慢病毒递送进行功能扰动；（3）Southern blot和qPCR，用于检测HepG2.2.15细胞和Huh7-NTCP细胞中的HBV DNA物种（包括cccDNA富集部分和总HBV DNA）；（4）bulk ATAC-seq和RNA-seq，用于分析CRISPR/Cas9处理后宿主全基因组染色质可及性和转录组变化。
研究结果如下：
**2.1 Rarely Open Chromatin Regions in HBV cccDNA**：通过对HBV感染PXB细胞进行scATAC-seq分析，研究人员发现HBV基因组中存在三个离散区域（约800-1000 bp、2000-2200 bp和2500-2700 bp）表现出Tn5插入频率显著降低，定义为罕见开放染色质区域（rOCRs）。Stacked read可视化显示，大多数cccDNA分子在这些区域可及性受限，仅少数分子延伸穿过，表明cccDNA存在异质性染色质状态。
**2.2 Functional Perturbation of Rarely Open Chromatin Regions by CRISPR/Cas9**：基于rOCR的序列保守性和PAM分布，研究人员比较了不同HBV基因型（C2、D2、C），选择839-909 bp区域（富含PAM基序且保守性高）作为gRNA靶点，并在Huh7-NTCP和HepG2.2.15细胞中进行功能验证。
**2.3 CRISPR/Cas9 Targeting of an Accessibility cccDNA Region Suppresses HBV Replication in the De Novo Infection Model**：在Huh7-NTCP细胞新生感染模型中，CRISPR/Cas9靶向可及性相关区域后，qPCR检测显示cccDNA和总HBV DNA水平较对照组显著降低（p < 0.01），表明病毒复制受到抑制。
**2.4 Complementary Molecular Analyses in HepG2.2.15 Cells**：在HepG2.2.15细胞中，Southern blot检测到多种HBV DNA物种（rcDNA、线性DNA、cccDNA、ssDNA）减少；qPCR确认cccDNA和总HBV DNA显著降低。Bulk ATAC-seq显示靶区域周围ATAC-seq reads覆盖度降低，表明染色质结构被扰动。额外gRNA（靶向1200 bp区域）对比显示原gRNA-800效果更优。siRNA（靶向859 nt）和恩替卡韦（逆转录抑制剂）处理表明，CRISPR/Cas9的抗病毒作用不能完全由转录抑制或逆转录抑制解释。
**2.5 Host Chromatin and Transcriptional Responses Following CRISPR/Cas9 Targeting**：全基因组ATAC-seq和RNA-seq分析显示，CRISPR/Cas9处理后宿主染色质可及性发生广泛改变，差异表达基因富集于细胞形态发生、细胞骨架组织、细胞连接组装和RHO GTPase信号等通路。NAP1L1和CEP68等基因表现出染色质可及性和/或表达变化，提示其可能参与宿主对cccDNA扰动的反应。在HepG2.2.15细胞中也观察到类似的宿主染色质和转录协调变化。
讨论部分指出，单分子染色质可及性分析揭示cccDNA并非结构均匀，而是存在异质性染色质状态。本研究作为概念验证，采用染色质可及性分析识别候选靶区域，并证实CRISPR/Cas9扰动可及性相关区域与HBV DNA信号减少相关。但研究未区分抗病毒效应是因可及性相关脆弱性、功能性序列破坏还是两者共同作用，且存在局限性，包括HepG2.2.15细胞含整合的HBV DNA、qPCR无法完全排除非cccDNA贡献、未进行全基因组脱靶分析、未系统比较多个gRNA、以及可及性区域在不同基因型中的保守性尚不完全明确。研究结论翻译如下：可及性引导的HBV cccDNA靶向为基于序列的传统方法提供了补充框架。本研究通过染色质可及性分析识别出可重复的相对低可及性区域，且CRISPR/Cas9扰动一个代表性可及性相关区域与互补HBV实验系统中HBV DNA相关信号的减少一致。尽管染色质可及性与基因组编辑易感性之间的机制关系尚待完全阐明，但本研究结果支持将染色质可及性分析作为识别候选cccDNA靶区域的概念验证框架，用于未来HBV治疗研究。
