整合光热PCR与swCNT-FET技术的PHANTOM平台，用于快速分子诊断

《Biosensors and Bioelectronics》：PHANTOM Platform Integrating Photothermal PCR and swCNT-FET for Rapid Molecular Diagnostics

　　

摘要

等离子体光热聚合酶链反应是一种核酸扩增技术，它利用等离子体纳米材料在特定波长光照射下的局域表面等离子体共振效应来实现快速的热循环。由于其在即时诊断应用中的潜力以及快速、灵敏且准确的检测性能，PPT-PCR被视为下一代PCR技术。在本研究中，我们提出了PHANTOM这一概念验证系统，该系统将等离子体光热PCR、磁性纳米颗粒去除以及基于单壁碳纳米管场效应晶体管的无标记电学检测功能整合在一起，用于快速分子诊断。这种单壁碳纳米管场效应晶体管传感器具有高灵敏度，能够在PPT-PCR扩增后几分钟内检测到低浓度的目标核酸。此外，为提高检测的特异性，我们采用了发夹结构引物，使得扩增产物具有外部单链尾，能够与经过修饰的单壁碳纳米管场效应晶体管传感器上的探针发生杂交。通过这种设计，我们在20分钟内实现了1.5阿摩尔的检测限（实验验证下限可达10阿摩尔）。

引言

近年来全球范围内传染病的爆发，包括COVID-19大流行，凸显了对于快速、准确且便携式诊断技术的迫切需求[1]、[2]、[3]。虽然聚合酶链反应仍是核酸检测的金标准，但其对集中式基础设施、漫长的热循环过程以及专业人员的依赖，限制了其在即时检测和资源匮乏环境中的应用[4]、[5]、[6]、[7]、[8]。

为克服这些限制，等离子体PCR作为一种有望加速DNA扩增的技术应运而生，它通过光热转换实现扩增[8]、[9]、[10]、[11]、[12]、[13]、[14]、[15]。其核心原理是局域表面等离子体共振，即特定波长的光促使等离子体纳米材料表面的传导电子发生集体振荡，非辐射松弛产生的热量会迅速传递到周围溶液中[16]、[17]、[18]。均匀分散的等离子体纳米颗粒 thus可充当纳米级加热器，从而在整个扩增过程中实现精确且均匀的热控制。

微流控技术的集成进一步实现了精确的温度调控、降低试剂消耗以及紧凑的芯片式操作[19]、[20]，而手掌大小的PPT-PCR设备则证明了在即时检测和野外环境中应用集成诊断技术的可行性^[20]。

然而，传统的基于荧光的检测方法仍然存在体积庞大且成本高昂的问题，这阻碍了其微型化发展[21]、[22]、[23]、[24]，而且等离子体纳米颗粒还可能抑制荧光信号，降低检测灵敏度[9]、[12]、[15]、[20]、[25]。基于场效应晶体管的生物传感器则提供了一种替代方案[24]、[26]、[27]、[28]，它无需标记即可实现高灵敏度的检测，且易于微型化，还能与等离子体纳米材料结合用于集成扩增和检测[26]、[27]、[28]、[29]、[30]。其中，单壁碳纳米管场效应晶体管在核酸检测方面尤为出色[31]、[32]、[33]；它们具有高导电性、较大的表面积与体积比，以及无需标记即可实现实时响应的特性，因此无需复杂的光学装置^[34]，同时其可通过溶液加工工艺，并且适合卷对卷打印，便于大规模生产[35]、[36]。这些优点使得单壁碳纳米管场效应晶体管成为一种理想的平台，可用于开发便携、低功耗的诊断设备，与PPT-PCR相辅相成。

尽管具有这些优势，基于场效应晶体管的核酸传感器在实际应用中仍面临一些关键限制^[31]。在如10毫摩尔/升磷酸盐缓冲液这样的生理缓冲液中，较高的离子强度会使德拜长度缩短至约0.7纳米，从而限制了有效的检测范围^[37]，也无法检测到该距离之外的杂交事件^[38]。将缓冲液浓度降至1毫摩尔/升磷酸盐缓冲液后，德拜长度可延长至约2.3纳米，这样在杂交过程中就能更有效地调节电荷状态[37]、[39]、[40]。此外，还存在非特异性结合、基质干扰以及环境变化等挑战[41]、[42]、[43]。而且，单壁碳纳米管场效应晶体管对单链核酸有良好的响应，但由于电荷传递受限，其对双链PCR扩增产物的灵敏度较低[31]、[44]，因此需要一些方法来暴露出单链区域，以便在扩增后进行检测。

为解决这些问题，我们提出了PHANTOM这一概念验证系统，它将PPT-PCR扩增、磁性纳米颗粒去除以及基于单壁碳纳米管场效应晶体管的电学检测功能按照顺序整合在同一个系统中。该系统的关键设计特点在于采用了发夹结构引物，这种引物能生成带有单链突出端部的PCR扩增产物，而这些突出端部恰好可以与经过探针修饰的场效应晶体管通道发生杂交，从而实现无标记的电学检测。为减少残留的PCR基质成分，如蛋白质和盐类带来的非特异性吸附，人们会在单壁碳纳米管场效应晶体管表面涂覆牛血清白蛋白，以此抑制基线电流的波动，提高检测结果的重复性^[31]。这一策略提升了PCR产物与基于场效应晶体管的检测系统之间的兼容性，从而使检测能够更灵敏地针对特定目标进行分析。我们将这一概念验证系统命名为“光热混合扩增与纳米生物电转导用于现场分子诊断”平台（PHANTOM平台，见图1）。目前而言，PHANTOM已经实现了扩增、磁分离以及电学检测功能的整合，但要真正应用于即时检测，还需要进一步缩小流体处理装置、光学对准装置以及控制电路的尺寸。

章节节选

等离子体磁性纳米颗粒的特性分析

在本研究中，我们使用了双功能等离子体磁性纳米颗粒作为PPT-PCR中的光热热源。每个这类纳米颗粒都有一个被完整金壳均匀包裹的铁氧体核心，这一结构既有助于产生热量，又便于进行磁力操控。金壳能够在光照射下高效且均匀地产生热量，而磁性核心则可在PCR扩增完成后通过磁力将纳米颗粒分离出来，避免它们对后续检测造成干扰

结论

在本研究中，我们开发并验证了PHANTOM这一概念验证型集成原型——一种便携式诊断平台，它将PPT-PCR技术与单壁碳纳米管场效应晶体管检测技术相结合，可实现快速、无标记的核酸定量分析。借助核壳结构等离子体磁性纳米颗粒的局域表面等离子体共振效应，PPT-PCR模块能够在15分钟内完成35次热循环，这一速度远远快于传统的热循环仪。而经过探针修饰的单壁碳纳米管场效应晶体管则能够实现基于探针的

材料

所有化学试剂均为分析级产品，直接使用。有关化学品、供应商以及寡核苷酸序列（包括发夹结构的前引物、后引物、探针DNA以及合成的HIV目标DNA）的详细信息详见补充资料。

模拟分析

我们使用NUPACK软件（dna04.2模型）在72摄氏度、55摄氏度以及25摄氏度下对DNA二级结构及杂交现象进行了热力学分析，这三个温度分别对应PPT-PCR的延伸阶段、退火阶段以及场效应晶体管检测阶段

CRediT作者贡献说明

彭永康：文章撰写——审阅与编辑，文章撰写——初稿撰写，研究指导，方法设计，概念构思。南智敏：文章撰写——审阅与编辑，文章撰写——初稿撰写，研究指导，资源协调，方法设计，概念构思。金泰勋：文章撰写——审阅与编辑，文章撰写——初稿撰写，研究指导，资源协调，方法设计，资金筹集，概念构思。李正勋：文章撰写——审阅与编辑，文章撰写——初稿撰写，研究指导，资源协调，方法设计，

未引用参考文献

[53]。

利益冲突声明

作者们已就相关原理及制造方法申请了一项专利。

数据可用性声明

本研究的相关数据可在合理请求下从相应作者处获取。

利益冲突声明

? 作者们声明自己不存在任何可能影响本文研究结果的已知利益冲突或个人关系。

致谢

本研究得到了韩国国家研究基金会（NRF）的资助，这些资金由韩国政府科技信息通信部提供（项目编号为RS-2026-25469493、RS-2025-00517697、RS-2025-00517713、RS-2025-00559158、RS-2021-NR060121），同时还获得了韩国基础科学研究所（国家研究设施与设备中心）的资助，该资助由韩国教育部门提供（项目编号为RS-2022-NF000922），此外还得到了韩国国家研究机构的全球学习与学术研究项目（G-LAMP）的支持

Jingrui Wu|Da Eun Oh|Hyunju Cho|Jiwoong Son|Hua Mi|Hong-seog Park|Yung-Kang Peng|Jwa-Min Nam|Tae Hyun Kim|Jung-Hoon Lee

韩国首尔大学化学系，首尔08826