发育因素驱动出生后早期小肠上皮的分区化和不连续成熟

《PLOS Biology》：Developmental factors drive the compartmentalized and discontinuous maturation of the small intestinal epithelium during the early postnatal period

　　

出生后时期（postnatal period）是一个关键时间窗口，伴随着从胎盘能量供应到肠内喂养的过渡、肠道微生物群（enteric microbiota）的建立以及出生后免疫成熟，但小肠上皮（small intestinal epithelium）在此期间的时空和细胞多样性尚未得到系统研究。在此，研究人员使用激光捕获显微切割（laser capture microdissection, LCM）和批量RNA测序（bulk RNA-Seq）、蛋白质组学（proteomics）以及单细胞RNA测序（single cell RNA-Seq, scRNA-Seq），分析了出生后期间无特定病原体（specific pathogen-free, SPF）、无菌（germ-free, GF）和沙门氏菌（Salmonella）感染小鼠的总、器官部位、隐窝（crypt）和绒毛（villus）特异性肠上皮。研究人员识别了关键的时间性和器官部位特异性表达模式，揭示了早期生命中微生物群（microbiota）的微弱影响，但发育调控因子（developmental regulators）的强烈影响。研究人员还确定了年龄依赖性信号通路（signaling pathway）和转录因子（transcription factor, TF）活性，并表征了年龄和细胞类型特异性发育轨迹，揭示了沿近端到远端长度和隐窝-绒毛轴（crypt-villus axis）的明显分区化成熟过程，以及杯状细胞/潘氏细胞（goblet/Paneth cell）和吸收性肠细胞（absorptive enterocyte）转录谱的不连续出现。最后，研究人员描述了新生儿肠道感染（neonatal enteric infection）的细胞类型特异性反应。综上所述，研究人员的发现将上皮识别为出生后黏膜组织成熟和宿主-微生物稳态（host-microbe homeostasis）建立中的关键组成部分。

论文解读文章

**研究背景与问题**

小肠上皮（small intestinal epithelium）在消化吸收营养、形成物理化学黏膜屏障限制腔内肠道微生物群，以及感染时作为第一道防线中发挥关键作用。出生后早期是一个关键时间窗口，伴随从胎盘能量供应到肠内喂养的过渡、肠道微生物群的建立以及出生后免疫成熟，但该阶段上皮的时空和细胞多样性尚未得到系统研究。目前存在的主要问题包括：新生期肠道上皮与成年宿主存在显著差异，如隐窝（crypt）和潘氏细胞（Paneth cell）在出生后第二周才出现，缺乏明确的TA细胞（transit amplifying cell）和连续的隐窝-绒毛迁移（crypt-villus migration）；此外，胎儿型肠细胞（fetal-type enterocyte）的吞噬功能和胞葬作用仅限于新生期。尽管有研究观察到新生期与成年小鼠之间代谢酶、分化因子、先天免疫感知和抗菌宿主防御分子的转录差异，但环境因素（如微生物群）与发育调控因子在驱动早期上皮成熟中的相对作用尚不明确。因此，开展这项研究旨在系统表征出生后期间小肠上皮的多维变化，特别是从新生到成年过渡中的时空、细胞类型特异性转录和蛋白质组学特征，以理解其成熟机制及对宿主-微生物稳态的影响。该论文发表在《PLOS Biology》。

**主要关键技术方法**

研究人员采用激光捕获显微切割（laser capture microdissection, LCM）结合批量RNA测序（bulk RNA-Seq）和蛋白质组学（proteomics），以及单细胞RNA测序（single cell RNA-Seq, scRNA-Seq），分析了来自无特定病原体（specific pathogen-free, SPF）、无菌（germ-free, GF）和沙门氏菌（Salmonella Typhimurium）感染小鼠的小肠上皮样本。样本队列来源于C57BL/6J小鼠，SPF小鼠在RWTH亚琛大学医院实验室动物科学研究所饲养，GF小鼠由Tom Clavel和Susan A. Jennings提供。时间点包括出生后1、5、10、25天，以及感染后第4天（对应5天龄）。主要技术包括：EDTA分离上皮细胞进行bulk RNA-Seq和蛋白质组学；LCM分离隐窝/绒毛区域进行3'RNA-Seq；流式分选EpCAM⁺CD45^-活细胞进行scRNA-Seq；以及生物信息学分析如差异表达、通路活性（PROGENy）、转录因子活性（DoRothEA）和伪时间轨迹（Slingshot）。忽略试剂和具体培养、质粒构建操作步骤。

**研究结果**

1. **发育因素而非微生物因素驱动出生后早期全局转录组变化**：通过bulk RNA-Seq分析1、5、10、25天龄SPF小鼠总小肠上皮，主成分分析（PCA）显示断奶前（1-10天）和断奶后（25天）样本显著分离。差异表达基因（DE gene）分析发现，断奶时抗菌肽（如Reg3a、Reg3b、Reg3g）、消化酶（如Treh、Sis）和葡萄糖转运体（如Slc2a2）显著上调，而胎儿型肠细胞相关基因（如Dab2、Mamdc4）和铁转运体（如Trf）下调。时间模式分析表明，NND和NNU模式（即断奶前后变化）与BLIMP1和MAFB两个发育调控转录因子的靶基因显著相关。比较SPF和GF小鼠发现，断奶前微生物群对上皮转录组影响极小，支持发育因素的主导作用。

2. **出生后期间及断奶时肠上皮蛋白质组变化**：蛋白质组学分析检测到4562种蛋白质，其中4160种与转录组重叠。PCA同样显示断奶前后显著差异。断奶时上调的蛋白质包括潘氏细胞相关抗菌分子（如DEFA、LYZ1）、代谢酶（如SIS、TREH）和紧密连接蛋白（如CLDN15）。值得注意的是，1天到5天之间蛋白质上调数量远超转录组，部分原因可归因于乳腺来源的乳蛋白（如WAP、MFGE8）在胎儿型肠细胞中的内吞，以及自噬相关蛋白（如ATG3）的上调，反映了出生后能量短缺诱导的自噬活动。

3. **隐窝-绒毛轴的年龄依赖性基因表达分区化**：结合LCM和bulk RNA-Seq分析隐窝（或离乳前绒毛间区）和绒毛上皮，发现所有年龄均存在隐窝-绒毛转录组分离，但新生期程度较低。断奶后隐窝上皮特征为潘氏细胞相关抗菌基因（如Defa、Reg3b）上调，而绒毛上皮则富集营养消化和转运基因（如Treh、Slc28a1）。胎儿型肠细胞标志物（如Rab30、Ctsl）在断奶前隐窝和绒毛中均高表达，而IgA转运分子pIgR在断奶后显著增加。

4. **小肠近端-远端长度的转录差异**：沿小肠近端、中部和远端采集上皮，PCA显示断奶前后变化主导，但分段差异在PC2轴分离。断奶样本的段特异性基因表达模式与成年小鼠已知分区（A-E域）一致，但新生期对应性较差。层次聚类识别5个主要簇：簇1（染色质分离）在断奶后所有段上调，但近端在10天时已提前激活；簇3（细胞外基质组织）在出生时近端最高，提示早期组织重塑；簇5（溶酶体组织）在断奶前远端持续表达，反映胎儿型肠细胞在远端小肠的持久性；簇2（抗菌反应和脂肪酸代谢）在断奶后均匀上调。这些结果表明近端至远端的发育波，近端成熟更早。

5. **单细胞转录分析揭示年龄和细胞类型特异性发育轨迹**：scRNA-Seq分析15,582个高质量细胞，识别出所有主要上皮细胞类型。对吸收性肠细胞亚群分析，发现年龄依赖性代谢过程变化（如脂肪酸代谢上调）和TGF-β信号在5-10天龄间增强。伪时间轨迹分析显示，断奶前吸收性肠细胞沿隐窝-绒毛轴分化，早期核糖体活性高，晚期细胞转运强。对杯状细胞/潘氏细胞亚群分析，发现伪时间轨迹朝向Zg16阳性细胞，识别出分化相关的DE基因和转录因子。肠内分泌细胞（EEC）亚群在出生后各年龄以相似丰度存在，7个已知亚型均被检测到。

6. **肠道感染的全局和细胞类型特异性反应**：分析沙门氏菌感染后4天的小肠上皮，bulk RNA-Seq显示感染诱导典型抗菌宿主反应基因（如Reg3g、S100a8、Nos2）上调，而α-防御素不变。scRNA-Seq发现吸收性肠细胞丰度显著下降，而其他细胞类型（如潘氏细胞、杯状细胞、簇细胞）更具抵抗力。细胞类型特异性分析显示，吸收性肠细胞中离子转运和外在凋亡信号通路被诱导，而杯状细胞/潘氏细胞中先天免疫反应通路（如PRR信号）被激活。

**总结讨论与结论**

讨论部分指出，研究结果揭示了新生期小肠上皮的复杂性和异质性，特别是出生后早期基因和蛋白质表达的显著变化，这些变化可能有助于出生后过渡。尽管新生期缺乏器官部位特异性微生物群组成、明确的隐窝和减少的黏液产生，但近端-远端以及隐窝-绒毛之间的转录差异与成年宿主同样显著。此外，在断奶前，微生物群对上皮表达的影响极小，表明发育编程在新生期上皮成熟中起主导作用。研究还强调了胎儿型肠细胞和自噬在适应出生后能量短缺中的独特作用。结论部分翻译如下：研究人员使用最先进的方法和模型，表征了出生后不同时间点肠道上皮的全局、器官和部位特异性以及单细胞转录和蛋白质组学谱。研究结果识别并表征了关键的时间性、器官部位和细胞类型特异性基因表达谱，确定了年龄依赖性信号通路活性，并定义了年龄和细胞类型特异性转录因子活性，表明出生后早期发育因素影响强烈而肠道微生物群影响微弱。研究人员表征了单个细胞类型的年龄依赖性发育轨迹，突出了特定细胞类型的分区化和不连续转录谱，并描述了新生儿肠道感染的全局和细胞类型特异性反应。这些发现为理解出生后过渡的复杂性提供了基础，并有助于识别降低儿童死亡率、促进黏膜稳态和长期健康的策略。