《PLOS Computational Biology》：Accurate de novo transcription unit annotation from run-on and sequencing data
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功能元件注释是用于洞察控制细胞发育、分化和疾病的分子过程的关键工具。运行测序分析测量新生RNA的产生，可以为发现功能元件提供有效的数据源。然而，由于信号具有噪声且难以建模，从运行测序数据中准确推断功能元件仍然是一个悬而未决的问题。在此，研究人员研究了将运行测序
功能元件注释是用于洞察控制细胞发育、分化和疾病的分子过程的关键工具。运行测序分析测量新生RNA的产生，可以为发现功能元件提供有效的数据源。然而，由于信号具有噪声且难以建模，从运行测序数据中准确推断功能元件仍然是一个悬而未决的问题。在此，研究人员研究了将运行测序数据转化为代表转录单元（包括基因和非编码RNA）注释的计算方法。研究人员开发了一种称为使用PRO-seq的基因解剖学卷积发现（CGAP）的卷积神经网络（CNN），经过训练以识别转录单元的不同解剖学特征，随后使用隐马尔可夫模型（HMM）将这些特征拼接成转录注释。与现有方法进行比较表明，使用研究人员新颖的CGAP-HMM方法取得了显著的性能提升。研究人员开发了一种集成排名前三的注释策略的投票系统，与表现最好的单一方法相比，在转录单元注释准确性上取得了巨大且显著的提升。最后，研究人员还探索了条件生成对抗网络（cGAN）作为转录单元注释的可能替代方法。总的来说，研究人员的工作为从运行测序数据中进行从头转录单元注释提供了新颖的工具，这些工具足够准确，适用于在许多实际应用场景。
基因组编码着各种功能元件，为细胞发育、分化和稳态提供操作指令，而注释这些功能元件的位置和条件活动是现代遗传学的关键目标。在人类和小鼠中，联合体通过整合多种实验（如ChIP-seq、DNase、mRNA-seq）来注释蛋白质编码和非编码mRNA，但这种基于多功能实验整合的方法需要大量资源。随着测序整个生命之树项目的推进，亟需一种能从单一实验中最大化提取信息以替代多种实验整合的注释策略。RNA聚合酶II（Pol II）在转录所有蛋白质编码基因和大多数非编码RNA时会留下特征性模式，直接捕获聚合酶的精度核运行测序（PRO-seq）能够提供全基因组测量数据。然而PRO-seq数据存在信号极度嘈杂的问题，现有计算方法多侧重于单独发现转录起始区或转录单元边界。为此，研究人员开展了一项基于机器学习策略的研究，旨在识别活动转录单元中与多个解剖标志相关的Pol II模式。研究得出结论：结合卷积神经网络与隐马尔可夫模型的CGAP-HMM方法能够高精度识别转录单元边界，且通过集成投票系统可进一步提升准确性。该研究为单一实验数据应用于基因组转录单元注释提供了有效工具。该论文发表在《PLOS Computational Biology》。
研究人员主要使用了以下几种关键技术方法开展研究：1. 构建了一个多类一维卷积神经网络（CNN），利用大约740,000个来自K562细胞系的基因组窗口及对应标签进行训练，采用指数增加的膨胀率残差块和MaxPool层提取不同尺度的序列特征；2. 引入隐马尔可夫模型（HMM），将神经网络预测的特征轨迹作为发射变量，利用伽马分布建模，将散乱预测平滑连接为连续的转录单元注释；3. 开发条件生成对抗网络（cGAN），采用修改版的编码器-解码器和PatchGAN架构，将转录单元注释构建为图像分割任务进行端到端的无监督映射学习；4. 使用基于RNA-seq比对数据的BRAKER3流程生成成熟的基因结构注释，并采用TUA分数和F1分数等多项指标在留存测试集上与现有工具进行定量性能评估比较。
多类CNN可识别转录单元中不同的解剖学标志
研究旨在发现活动基因中的解剖学标志。研究人员开发了名为使用PRO-seq的基因解剖学卷积发现（CGAP）的多类卷积神经网络，基于GENCODE注释、GRO-cap峰值等多种数据来源定义了15个代表转录单元不同部分的独立标签（包括转录起始位点TSS、基因体、稳定起始位点、不稳定起始位点、多聚腺苷酸剪切位点CPS等），利用非重叠50 bp窗口的PRO-seq信号进行训练。结果表明，CGAP能以较高的准确率（在K562细胞中平均精度为0.76，ROC AUC为0.95）精确区分解剖特征，并在基因组可视化中显示出特征预测与预期表现的极高一致性。
CGAP预测顺式调控元件处的稳定和不稳定转录
CGAP不仅能识别顺式调控元件（启动子和增强子），还能区分元件是否产生稳定或不稳定的转录。通过对CGAP的转录起始位点（TSS）预测进行分类并分析组蛋白修饰特征，研究得出结论：预测出具有稳定转录的TSS位点显著富集H3K4me3，而产生不稳定转录的TSS位点则相对富集H3K4me1。这复现了区分稳定和不稳定转录的经典染色质特征，证明该分类能捕捉现有注释工具无法获取的生物学差异。
CGAP-HMM使用CGAP标志读取转录单元的边界
考虑到原始PRO-seq数据存在极高噪声，单个神经网络无法直接构建跨越数千碱基的连续转录单元，因此研究人员采用隐马尔可夫模型（HMM）对CGAP输出进行平滑处理。通过将连续预测值作为发射变量，利用伽马分布建模，并使用基因起始预测作为协变量，构建了包含非转录、基因体和基因后转录三个状态的HMM模型。研究得出结论，与随机森林和多层感知机等判别方法相比，HMM平滑效果最佳，能高可靠性地将散落位点的预测平滑转化为边界连续的转录单元注释。
使用cGAN预测转录单元
为了克服需人工指定标签的局限性，研究人员开发了条件生成对抗网络（cGAN）。受图像分割处理启发，cGAN通过生成器和判别器对抗训练，直接学习将1.6 MB宽的PRO-seq信号映射到基因注释而不依赖HMM平滑。研究得出结论，尽管在长且高表达的基因上取得部分成效，cGAN表现欠佳，容易将注释断裂成多个小片段且难以检测负链转录，在多数基准测试中的表现劣于CGAP-HMM。
评估CGAP-HMM与基于RNA-seq数据的预测相比的优缺点
为了评估新生转录是否比RNA-seq数据更具信息优势，研究人员将PRO-seq衍生的CGAP-HMM与利用RNA-seq数据的BRAKER3流程进行了比较。研究得出结论：CGAP-HMM在识别活动转录起始位点、保存转录单元连续性和恢复活动启动子方面表现更优（TSS错误通常定位在TSS上游）；而BRAKER3在定义成熟外显子结构、转录异构体和准确的3'末端边界时更有优势（因成熟RNA-seq积累信息）。两者提供互补视图，CGAP-HMM更适用于研究具有细胞特异性的活动转录过程。
CGAP-HMM、cGAN与现有转录单元预测工具的性能比较
在基于高置信度GENCODE注释集的高评估中，研究人员将CGAP-HMM和cGAN与使用核运行分析的传统工具（groHMM和T-units）及多种决策树模型进行了比较。研究得出结论，CGAP-HMM在TUA分数、精确-召回F
1分数、解离与合并率平衡及多聚腺苷酸位点PAS误差控制上整体表现最优。而cGAN易拆散注释且高估长度。同时，基于HMM和CGAP-HMM通过集成投票构建的模型改善了单一方法高合并率或高解离率的缺点，表现出了最准确的注释性能。
在其他细胞类型/物种中评估模型
应用预训练的CGAP-HMM和集成模型，研究在5种额外人类细胞系及小鼠、马和果蝇的PRO-seq数据上进行了测试。研究得出结论：该方法在不同细胞系间表现出高度普适性，即便在低测序深度中也能识别相应特征；在哺乳动物（小鼠、马）中同样保持良好表现，尽管在小鼠中存在更高的解离和合并率。但在果蝇中由于基因密集度差异和缺乏启动子发散性特征，模型表现显著下降，表明向紧凑基因组迁移需要利用果蝇和酵母等数据进行重新训练。
讨论部分指出，研究结合了卷积神经网络特征检测与HMM平滑模型的互补优势，优于直接输入原始PRO-seq的传统方法，有效克服了噪声难题。条件生成对抗网络的无监督学习策略虽成功定位了部分转录起始位点，但难检测末端且易断裂，尚未超越CGAP-HMM的性能。研究总结结论认为：CGAP-HMM在跨物种应用中表现出高度普适性，对紧凑基因组的果蝇需重新训练。团队提出探究控制稳定与不稳定转录的特征和下游机制，以及应用LSTM网络联合训练和整合多种实验数据，是未来提升注释精度的系统和极具前景的研究方向。
