司美格鲁肽在人血浆中分析的灵敏HPLC-MS/MS方法的开发与验证

《Bioanalysis》：Development and validation of a sensitive HPLC-MS/MS method for the analysis of semaglutide in human plasma

　　

背景 司美格鲁肽（semaglutide）是一种人胰高血糖素样肽-1（GLP-1）肽类似物。迄今为止，文献中未报道使用三重四极杆质谱仪（triple-quadrupole mass spectrometer）定量人血浆中司美格鲁肽的支持药代动力学（pharmacokinetics）的验证性HPLC-MS/MS方法。研究人员提供了一种稳健、灵敏的HPLC-MS/MS测定方法，支持此类化合物，并展示了全面验证。方法与结果 研究人员开发并全面验证了一种三重四极杆HPLC-MS/MS方法，用于定量人血浆中的司美格鲁肽，使用稳定同位素标记内标（stable isotope labeled internal standard）和有效、高效的蛋白沉淀（protein precipitation）样品提取。该方法具有灵敏的分析范围5 ng/mL至200 ng/mL（通过稀释质量控制（QC）可扩展至1000 ng/mL），并表现出优异的准确度（92.7%至109.4%）和精密度（<10.6%）。这种高选择性方法提供了分析物的高回收率，且基质效应（matrix effects）极小。结论 一种稳健且简单的HPLC-MS/MS方法，用于定量人血浆中的司美格鲁肽，已根据2022年FDA M10指南（guidance）完全验证。该方法适用于在已验证的分析范围和稳定性条件下实施于临床研究，并可扩展至其他具有相似结构和理化性质的GLP-1肽类治疗药物的生物分析（bioanalysis）。

司美格鲁肽（semaglutide）是一种人胰高血糖素样肽-1（GLP-1）肽类似物，属于GLP-1受体激动剂类治疗性肽。近年来，由于修饰化学和分析技术的进步以及蛋白质组学的快速发展，治疗性肽，尤其是GLP-1受体激动剂，已成为新一代有效疗法。这类药物在治疗2型糖尿病和肥胖症方面表现出色，并显示出在抑郁症、主要心血管事件、青光眼、糖尿病视网膜病变和帕金森病等疾病中的潜在治疗价值。然而，肽类定量生物分析面临挑战，包括其高分子量、复杂结构、显著的内源性干扰、低体内浓度以及对非特异性结合（nonspecific binding）的易感性。传统上，肽和蛋白质生物分析技术主要依赖免疫测定，如酶联免疫吸附测定（enzyme-linked immunosorbent assay, ELISA），但其方法开发需要针对目标分析物的特异性抗体，且线性范围窄，抗体可能无法在结构上区分相关化合物或类似物，导致交叉反应。HPLC-MS/MS（高效液相色谱-串联质谱）克服了ELISA的障碍，凭借其更宽的动态范围、更高的准确度和特异性（无交叉反应），已成为GLP-1肽类生物分析的主要方法。目前，市场上存在多种基于ELISA的司美格鲁肽测定方法，但文献中尚未报道经过全面验证的用于人基质中司美格鲁肽定量的HPLC-MS/MS方法。因此，研究人员开展本研究，旨在开发并验证一种新颖、稳健的HPLC-MS/MS方法，用于定量人血浆中的司美格鲁肽，并依据2022年FDA M10指南进行全面验证，以支持临床药代动力学研究。该方法还可适用于其他具有类似结构和理化性质的GLP-1激动剂肽类治疗药物的生物分析。论文发表在《Bioanalysis》。

研究人员为开展研究使用了以下主要关键技术方法：采用三重四极杆HPLC-MS/MS系统（Sciex QTRAP 6500+质谱仪，Shimadzu Nexera X2 UPLC），以稳定同位素标记的司美格鲁肽（heavy semaglutide）作为内标（internal standard, IS），通过蛋白沉淀（protein precipitation）进行样品提取，使用SiliGuard^TM低结合深孔板和Eppendorf Protein Low-Bind管以减少非特异性结合。色谱柱为Phenomenex Kinetex C8（30×2.1 mm, 100?, 2.6 μm），流动相为含0.1%甲酸的水和乙腈。人血浆（K2EDTA）样本来源为BioIVT（美国纽约州伍德伯里）。方法验证涵盖线性与范围、准确度与精密度、选择性、回收率、溶血效应、脂血效应、基质效应、残留、稀释完整性、全血稳定性、冻融稳定性、长期稳定性、台式稳定性及再进样重现性，全部依据2022年FDA M10指南。

研究结果部分（保留小标题，并简要说明通过什么研究得出什么结论）：
3.1.1. 质谱结果：通过全Q1扫描和产物离子谱分析，选择司美格鲁肽的[M+4H]⁴⁺前体离子（m/z 1029.4）和产物离子（m/z 1238.2）作为MRM（多反应监测）通道，内标选择m/z 1039.1→1246.2，保留时间均为2.3分钟。
3.1.2. 校准曲线与范围：校准曲线范围为LLOQ（5 ng/mL）至ULOQ（200 ng/mL），8个浓度标准品准确度97.5%–103.5%，精密度1.7%–4.6%，相关系数>0.99（0.9984–0.9996），表明线性良好。
3.1.3. 准确度与精密度：通过分析4个浓度水平（LLOQ-QC、LQC、MQC、HQC）的六重复样品，批内准确度92.7%–109.4%，精密度2.0%–10.6%；批间准确度97.3%–99.6%，均符合接受标准。
3.1.4. 选择性：在6个不同个体血浆中，未观察到内源性成分对司美格鲁肽和内标保留时间处的显著干扰，峰面积百分比为LLOQ的1.9%–3.7%。
3.1.5. 回收率：司美格鲁肽的平均绝对回收率在LQC、MQC、HQC分别为83.3%、78.7%、79.7%，内标回收率为75.5%，回收率一致且重现。
3.1.6. 溶血效应：含2%溶血血液的LQC和HQC样品准确度分别为88.7%和96.0%，精密度分别为5.0%和7.2%，证明无溶血影响。
3.1.7. 脂血效应：在脂血血浆中制备的LQC和HQC准确度分别为93.3%和104.0%，精密度分别为12.5%和2.4%，证明无脂血影响。
3.1.8. 基质效应：使用6个不同血浆批次，LQC准确度91.3%–101.3%，精密度1.5%–8.2%；HQC准确度92.7%–103.3%，精密度2.5%–8.1%，表明基质效应可接受。
3.1.9. 残留：ULLOQ后空白血浆中司美格鲁肽平均响应为4.3%（0.0%–9.6%），内标平均响应为1.5%（0.1%–3.9%），满足残留标准。
3.1.10. 稀释完整性：1000 ng/mL的DQC经10倍稀释后，准确度88.3%，精密度1.8%，确认10倍稀释有效。
3.1.11. 全血稳定性：全血在室温及湿冰上放置2小时后，LQC差异分别为7.2%和10.6%，HQC差异分别为1.8%和10.2%，证明全血稳定2小时。
3.1.12. 冻融稳定性：5次冻融循环后，LQC准确度89.3%，精密度1.3%；HQC准确度94.7%，精密度4.2%，证明5次冻融稳定。
3.1.13. 长期稳定性：在?20°C储存97天后，LQC准确度104.7%，精密度8.5%；HQC准确度104.7%，精密度4.1%，证明长期稳定97天。
3.1.14. 台式稳定性：室温放置24小时后，LQC准确度91.3%，精密度7.1%；HQC准确度94.7%，精密度3.6%，证明台式稳定24小时。
3.1.15. 再进样重现性：提取后样品在6°C储存94小时后再进样，LQC准确度100.0%，精密度1.8%；MQC准确度96.7%，精密度5.9%；HQC准确度92.7%，精密度3.1%；标准曲线准确度97.8%–101.7%，证明再进样重现。
3.1.16. 储备液稳定性：司美格鲁肽储备液在室温下6小时差异2.8%，在6°C下7天差异8.5%，证明储备液稳定。

讨论部分总结：该全面验证的方法是一种稳健、灵敏的方法，能够使用稳定同位素内标定量人血浆中的司美格鲁肽，分析范围宽（5–1000 ng/mL）。该方法采用相对简单的蛋白沉淀三重四极杆HPLC-MS/MS，避免了以往GLP-1肽类似物提取中常用的固相萃取（SPE）或支撑液液萃取（SLE），这些方法耗时、成本高且回收率易变。验证依据2022年FDA M10指南，符合所有要求，可用于后续临床研究。该方法还可扩展至其他具有相似结构和理化性质的GLP-1激动剂肽类治疗药物的生物分析。目前，研究人员正在探索高分辨率8600 ZenoTOF质谱仪对本方法的评估，并比较其灵敏度。

研究结论部分翻译：提供了一种使用三重四极杆质谱仪对GLP-1受体激动剂司美格鲁肽进行定量的完全验证的生物分析方法。该验证方法满足2022年FDA M10指南在方法验证和样品分析方面的要求。描述了一种稳健且简单的样品提取程序。概述了特定的质谱参数。司美格鲁肽等GLP-1受体激动剂具有重要研究意义，因为除糖尿病和肥胖症外，它们正在被评估用于多种额外治疗应用，包括抑郁症、主要心血管事件、青光眼和帕金森病等，这强调了当前GLP-1受体激动剂生物分析的重要性。