快速、灵敏且可视化的逆转录重组酶辅助扩增结合侧向流试纸条检测乙型流感病毒方法

《Frontiers in Microbiology》：Development of a rapid, sensitive and visual reverse transcription recombinase-aided amplification coupled with lateral flow dipstick assay for influenza B virus detection

　　

引言：乙型流感病毒（IBV）是季节性流感的主要病原体，造成重大全球健康负担。快速准确检测对于疫情控制至关重要，但传统方法受限于复杂设备或长时间周转。方法：研究人员开发了一种逆转录重组酶辅助扩增结合侧向流试纸条（RT-RAA-LFD）检测方法，用于特异性检测IBV，靶向保守的ns基因。结果：经过引物筛选，确定最佳引物对F2/R4。优化后的反应条件为39^oC、20分钟，检测体积15 μL。分析验证显示出高灵敏度（50 copies/mL），且与其他常见呼吸道病毒（包括甲型流感病毒、SARS-CoV-2、副流感病毒和腺病毒）无交叉反应。临床性能评估显示与金标准PCR检测100%一致。讨论：建立的RT-RAA-LFD检测方法快速、特异、灵敏、易操作，无需依赖精密仪器，是乙型流感病毒即时检测（POCT）和现场监测的有前景工具。

**论文解读：基于RT-RAA-LFD的乙型流感病毒快速检测方法研究**

**研究背景与问题**

流感是一种由流感病毒引起的高度传染性呼吸道疾病，历史上有四次大流行，季节性流行每年导致约10亿感染、300万至500万重症病例及29万至65万死亡。乙型流感病毒（IBV）是季节性流感的主要病原体之一，近年来全球流行率上升，尤其在儿童中与高死亡率相关。免疫缺陷人群（如HIV感染者、儿童和老年人）感染后易出现重症。在感染早期，仅凭症状难以区分IBV与其他呼吸道病毒。快速、准确诊断对控制传播至关重要。传统方法中，逆转录聚合酶链反应（RT-PCR）灵敏度高（>95%）、特异性好，但依赖复杂热循环仪和专业操作人员，耗时较长，不适合基层医疗或即时检测（POCT）。快速流感诊断测试（RIDTs）操作简单、成本低、时间短（15-30分钟），但灵敏度低（50-70%）。血清学检测因抗体产生滞后不适用于急性感染诊断。病毒分离特异性100%但需专用实验室和3-10天培养周期。这些方法在灵敏度、速度和操作便捷性之间存在权衡。重组酶辅助扩增（RAA）是一种等温扩增技术，在37-42^oC恒温下5-30分钟完成，无需热循环，结合逆转录酶（RT）和侧向流试纸条（LFD）可实现可视化检测。RAA已被证明可灵敏、快速检测多种病原体，但在IBV检测中的应用较少。因此，研究人员开发了一种基于RT-RAA-LFD的IBV检测方法，旨在提供快速、灵敏、可视化的诊断工具，适用于资源有限环境和紧急情况。

**研究内容与结论**

研究人员成功建立了针对IBV保守ns基因的RT-RAA-LFD检测方法。该方法具有高分析灵敏度（50 copies/mL）和特异性，与常见呼吸道病毒无交叉反应，临床样本检测与RT-PCR完全一致（100%符合率）。研究发表在《Frontiers in Microbiology》。该方法快速（20分钟）、操作简便，无需精密仪器，适合POCT和现场监测，对IBV临床诊断和疾病控制具有重要意义。

**主要关键技术方法**

1. **样本来源**：49份咽拭子样本来自口岸入境无症状旅客，经两种商业RT-PCR试剂盒验证，其中19份阳性、30份阴性。其他呼吸道病毒阳性样本（甲型流感病毒H1N1、H3N2、SARS-CoV-2、呼吸道合胞病毒、副流感病毒1-3型、腺病毒1型）用于特异性评估。IBV假病毒由Fubio（苏州）生物技术有限公司合成。
2. **引物与探针设计**：基于GenBank下载的ns基因保守区序列，设计4条上游引物、4条下游引物和1条探针，正交配对筛选最佳组合。
3. **RT-RAA反应体系**：使用RAA核酸扩增试剂盒（LFD法），反应体积50 μL，包含引物、探针、模板RNA、镁离子等，在39^oC恒温摇床中孵育20分钟。
4. **LFD检测**：取10 μL扩增产物与90 μL PBS混合，加样至通用核酸试纸条，孵育5分钟，观察控制线（C线）和测试线（T线）显色。
5. **优化条件**：单因素法优化扩增温度（35-41^oC）、时间（5-30分钟）和样本体积（5-15 μL），通过ImageJ分析T线积分密度确定最佳参数。

**研究结果**

**筛选最佳引物**
通过正交配对筛选12对引物组合，其中F2/R4在两种IBV谱系（Victoria和Yamagata）中均表现出最短的峰值出现时间、典型扩增曲线和高荧光强度，被选为最佳引物对。

**优化RT-RAA-LFD反应条件**
在35-41^oC梯度温度下，T线强度相近，根据试剂盒说明选择39^oC（重组酶活性最高）。扩增5分钟即可检测到产物，20分钟时T线强度达到饱和，故选择20分钟。样本体积15 μL时T线最深，因此采用15 μL模板。

**分析灵敏度**
使用系列稀释的IBV假病毒RNA（100、50、25、10 copies/mL），在50 copies/mL浓度下仍可见清晰T线和C线，确定检测限（LOD）为50 copies/mL。

**分析特异性**
以IBV、甲型流感病毒（H1N1、H3N2）、SARS-CoV-2、副流感病毒1-3型、呼吸道合胞病毒和腺病毒1型核酸为模板，仅IBV出现T线和C线，其他病毒仅出现C线，表明无交叉反应，特异性优异。

**临床样本评估**
49份临床咽拭子样本（19份RT-qPCR阳性，Ct值28.37-38.73；30份阴性，Ct>42）中，所有阳性样本的RT-RAA-LFD均显示T线（灵敏度100%），所有阴性样本均无T线（特异性100%），与RT-qPCR的符合率为100%，Kappa值为1，表明临床适用性良好。

**讨论与结论**

**讨论**
该RT-RAA-LFD方法检测限为50 copies/mL，优于此前报道的CRISPR-Cas13a整合RAA（500 copies/μL）、双重RPA-LFD（50 copies/反应）和多重RT-LAMP（100 copies/μL）等方法，也优于商业RT-PCR试剂盒（100-500 copies/mL）。但需注意不同实验条件下LOD的可比性，未来需在统一条件下进行直接比较。该方法的特异性得益于靶向保守的ns基因，该基因相比结构基因（如HA）突变率低，避免了假阳性和假阴性。操作简便、恒温20分钟、LFD可视化，适用于POCT、偏远地区、大规模筛查等场景。局限性包括样本量小（49例）、阳性样本多样性不足（缺乏共感染和低病毒载量样本），且当前需要核酸提取步骤，可能引入污染。未来可整合CRISPR-Cas系统实现一管式检测，或开发多重平台同时检测多种呼吸道病原体。

**结论**
本研究中开发的针对保守ns基因的RT-RAA-LFD检测方法，在临床样本IBV检测中表现出高分析灵敏度、优异特异性以及与PCR的完全一致性。该方法在需要快速准确识别IBV的场景中具有巨大潜力，有望用于临床诊断和疾病控制。未来需进一步推动其更广泛应用。