定义人类足月蜕膜中调节性和常规CD4+ T细胞的特性、应答和驱动因素

《Frontiers in Immunology》：Defining nature, responses and drivers of regulatory- and conventional CD4+ T cells in the human term decidua

　　

背景：在哺乳动物妊娠期间，母体蜕膜中形成了免疫调节网络，促进胎儿发育，维持对胎儿抗原的耐受性并防止感染。其中，蜕膜调节性T细胞（Tregs）对妊娠成功至关重要。目的与方法：为理解健康人类妊娠中母体CD4⁺ Tregs和CD4⁺常规T细胞（Tconv）的特性与应答，研究人员通过单细胞转录组学（scRNAseq）和TCR测序（TCRseq）分析了足月剖宫产时蜕膜和血液中的这些细胞。结果：数据挖掘揭示了蜕膜CD4⁺ Tregs和Tconvs的新颖区分特征以及共享特征与功能。两种细胞类型均显示出在蜕膜中抗原识别和激活的证据，随后发生局部克隆扩增和效应分化。Tregs主要来源于胸腺来源（t）Treg谱系，具有自我反应性T细胞受体（TCR）库。Tregs局部扩增程度高于Tconvs，在肿瘤坏死因子受体2（TNFR2）共刺激驱动下分化为典型的非淋巴组织（NLT）驻留效应细胞，具有独特的细胞表面标志物和多种抑制功能。其他因素，包括干扰素（IFNs）、白细胞介素和催乳素，作为蜕膜Treg和Tconv效应分化的共同驱动因素。效应Tconvs具有细胞谱系区分的促炎和细胞毒性能力，受细胞内在和外在机制抑制，同时与Tregs共享糖酵解和抗原呈递特征。Treg和Tconv亚群显示出耗竭迹象，提示慢性抗原刺激。总体而言，观察到的特征表明整个妊娠期间蜕膜中存在持续的从头T细胞启动和动态T细胞更新。结论：研究人员的发现表明，非自身反应性CD4⁺ Tconvs和自身反应性tTregs在妊娠期间于淋巴器官中持续启动，被蜕膜中抗原重新激活并动态更新。在蜕膜中，CD4⁺ Tconvs和Tregs在特定细胞因子影响下扩增和分化为组织驻留效应细胞，具有相反且受抑制的促炎和抗炎功能，以及共享的抗原呈递能力。意义：蜕膜CD4⁺ Tregs和Tconvs的这些分子定义可用于在mRNA和蛋白质水平辅助诊断。此外，它们基于已知的T细胞谱系特征和组织适应性在健康和疾病中的外推，促进了对母胎耐受性的机制理解。

**论文解读：定义人类足月蜕膜中调节性和常规CD4⁺ T细胞的特性、应答与驱动因素**

**研究背景与问题**

在哺乳动物妊娠中，母体蜕膜（decidua）形成免疫调节网络，以支持胎儿发育、维持对胎儿抗原的免疫耐受并抵御感染。蜕膜调节性T细胞（Tregs）对妊娠成功至关重要，但其来源、应答特征及与常规CD4⁺ T细胞（Tconvs）的关系尚不完全清楚。关键问题包括：蜕膜Tregs是胸腺来源（tTregs）还是外周诱导（pTregs）？它们在蜕膜中如何被激活、扩增和分化？哪些信号驱动这些过程？Tregs与Tconvs在功能上有何异同？此前研究多基于表型标记（如CD4⁺CD25^high）或早孕期样本，缺乏对足月妊娠时全蜕膜（包括基底蜕膜（DB）和壁蜕膜（DP））以及母血和脐血（UCB）的系统性单细胞分析。因此，研究人员开展此项研究，旨在通过单细胞转录组学（scRNAseq）和TCR测序（TCRseq）全面解析足月剖宫产（C-section）时人类蜕膜CD4⁺ Tregs和Tconvs的特性、应答及驱动因素，为理解母胎耐受机制提供分子基础。该论文发表在《Frontiers in Immunology》。

**主要技术方法**

研究人员从莱顿大学医学中心招募了10名健康足月妊娠且行剖宫产的供者（其中3名用于scRNAseq/TCRseq，3名用于流式细胞术分析，4名用于额外验证）。从母体外周血（mPB）、脐带血（UCB）、基底蜕膜（DB）和壁蜕膜（DP）中分离单核细胞。通过流式细胞术分选CD4⁺ Tregs（基于CD25^hiCD26^low（蜕膜）或CD25^hiCD127^low（血液））和Tconvs（CD25^low/intCD26⁺（蜕膜）或CD25^lowCD127⁺（血液））。采用Chromium X平台（10x Genomics）进行单细胞5'基因表达和V(D)J文库构建，基于CellRanger和Seurat包进行数据分析，并利用TCRseq分析克隆扩增和克隆关系。流式细胞术使用5激光Cytek Aurora进行表型验证。此外，利用IPA（Ingenuity Pathway Analysis）进行上游调控因子分析，并与公共癌症数据集（如Zheng et al.的泛癌图谱和Veatch et al.的黑色素瘤浸润CD4⁺ T细胞数据）进行转录组比较。

**研究结果**

**3.1 分离与流式细胞表型分析**：通过流式细胞术发现，蜕膜（DP和DB）中CD4⁺ Tregs和Tconvs主要为CD45RO⁺效应表型，而mPB和UCB中主要为CD45RA⁺初始表型。蜕膜Tregs表达更高水平的FOXP3、CD25、CTLA-4和PD-1，提示持续的TCR参与。

**3.2 scRNA测序鉴定Treg和Tconv簇**：scRNAseq分析将蜕膜CD4⁺ T细胞分为8个簇（0-7），其中簇1、2、5、6为Treg（FOXP3⁺），簇0、3、4、7为Tconv（FOXP3^-）。Treg簇2和Tconv簇3在DP中富集。Tconv簇0和7表达CCR7和TCF7，呈现干细胞样状态。血液CD4⁺ T细胞分6个簇，多数为干细胞样，仅簇5为效应Treg。

**3.3 蜕膜支持tTreg和Tconv的克隆扩增**：TCRseq显示，Tregs中扩增克隆（≥2细胞）比例高于Tconvs，且Treg簇1、2和Tconv簇3扩增最显著。大多数克隆型在相同谱系内共享，而非在Treg与Tconv之间共享，表明蜕膜Tregs主要为tTregs，而非pTregs。tTreg核心特征基因在蜕膜Treg簇中显著富集。血中效应Treg（簇5）与蜕膜Treg簇共享克隆型，提示Treg从母血迁移至蜕膜。

**3.4 鉴定活跃信号转导的Treg和Tconv簇**：基因表达模块分析显示，模块II（616个基因）在Treg簇5和Tconv簇7中共同高表达，富集淋巴细胞激活、组蛋白修饰、TCR/CD28信号、TNFR信号、白细胞介素信号及染色质重塑通路，表明这些细胞处于抗原驱动的激活状态。

**3.5 效应Treg和Tconv共享抗原呈递与代谢特征**：模块IV（263个基因）在Treg簇1、2和Tconv簇3中共同高表达，富集抗原加工与呈递（MHC-I和MHC-II）、糖酵解和ATP代谢过程。Tregs和Tconvs均上调HLA、蛋白酶体亚基、糖酵解酶及线粒体呼吸链组分，提示共享抗原呈递和糖酵解能力。

**3.6 蜕膜Treg和Tconv的膜受体与潜在效应功能**：模块IV还包含共抑制受体（CTLA4、PDCD1、TIGIT等）和共刺激分子（TNFRSF18等）。Treg簇2特异性高表达NLT驻留效应Treg（eTreg）标志物（FOXP3、IKZF2、BATF、TNFRSF4/9/18、TIGIT、CCR8、LAYN、ENTPD1），而Tconv簇3特异性高表达细胞毒性效应分子（颗粒酶、IFNG）。模块III为Tconv特异性基因，富集细胞毒性颗粒、自分泌IFN信号、趋化因子等。

**3.7 Treg从信号状态向效应状态转变的变化**：模块I（109个基因）在Treg簇5、2、1中表达，包括TNF/NF-κB信号、TNFR2、TNFRSF4/9/18、FOXP3、IKZF2、BATF、PRDM1、VDR等，提示TNFR2共刺激驱动tTreg分化为NLT驻留eTreg。

**3.8 Treg和Tconv效应分化的驱动因素**：IPA上游调控因子分析显示，Treg和Tconv效应分化均受I型/II型IFN、IL-2、IL-1B、催乳素（PRL）等驱动。TNF靶基因在Treg簇5和2中富集，Treg特异性表达TNFR2，且TNFR2驱动基因特征在Treg簇中显著，支持TNFR2在体内驱动蜕膜eTreg分化。

**3.9 蜕膜T细胞与肿瘤微环境T细胞的比较**：蜕膜Treg的模块I基因特征在泛癌Treg簇（Treg.TNFSF9和Treg.OAS）中富集。CXCL13⁺TCF7^-效应/耗竭肿瘤特异性CD4⁺ Tconv特征在蜕膜Tconv簇3和Treg簇2中富集，提示持续TCR信号导致的效应分化与耗竭特征。

**总结与讨论**

研究人员通过足月剖宫产样本的单细胞转录组和TCR测序，揭示了蜕膜CD4⁺ Tregs主要为tTregs，而非pTregs，它们与Tconvs在克隆上不重叠，并表达tTreg核心特征。蜕膜Tregs和Tconvs均经历局部抗原识别、克隆扩增和效应分化，其中Tregs扩增更显著，并在TNFR2共刺激驱动下分化为NLT驻留eTregs，表达CTLA-4、CD39等抑制分子。效应Tconvs则具有促炎和细胞毒性能力，但受内在抑制受体和Tregs的外在调控。两种细胞均共享MHC-I/II抗原呈递和糖酵解能力。持续TCR刺激导致细胞表达耗竭标志。研究结论：蜕膜CD4⁺ Tregs和Tconvs在妊娠期间持续从淋巴器官启动，迁移至蜕膜后被抗原重新激活、动态更新，并在特定细胞因子（TNFR2、IFNs、IL-2、催乳素等）作用下分化为具有相反但受控功能的组织驻留效应细胞，同时共享抗原呈递能力。这些分子定义有助于诊断，并基于T细胞谱系特征和组织适应性外推，促进对母胎耐受机制的理解。